干细胞外泌体或成为糖尿病并发症治疗的又一武器
糖尿病的危害不仅仅是血糖升高，更严重的是由高血糖导致的一系列糖尿病并发症。近年来，研究发现干细胞外泌体对糖尿病并发症的治疗具有一定的作用，给糖尿病并发症的治疗带来了曙光。近期，来自中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院的徐向进教授2021年7月2～3日在山东济南召开的“中华医学会糖尿病学分会糖尿病胰岛调控与再生医学学组2021年学术年会”上详细介绍了干细胞外泌体在糖尿病并发症中的应用进展及前景。
什么是干细胞?
01
干细胞概述
干细胞具有无限增殖能力、多向分化潜能、分泌多种活化因子、调节微环境、活化内源性祖细胞等特性。干细胞在细胞替代治疗、发育生物学等领域的研究中有着独特的作用和优越性 [1]。
02
干细胞可用于治疗疾病
1999年，干细胞研究被美国《科学》杂志评为当年世界十大科学成就之首，干细胞技术随即成为社会各界普遍关注的热门议题。干细胞治疗已经在皮肤、心脏、眼睛、骨骼肌、神经组织、胰腺、血液等方面建立起了相应的疾病模型。目前干细胞可能治疗的疾病有：糖尿病及其并发症、阿尔茨海默病、心血管疾病、脑卒中、急慢性胰腺炎、皮肤创伤、皮肤衰老、各种癌症等。
03
干细胞治疗T2DM的动物研究
研究表明 [2~3]，人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）对T2DM大鼠胰岛功能改善的作用机制可能与下调TLR4及NF-κB炎症信号通路相关，利拉鲁肽联合HUC-MSCs干预对T2DM大鼠的糖代谢及胰岛分泌功能具有改善作用，HUC-MSCs移植通过介导T2DM大鼠ASK1/JNK/BAX通路抑制胰岛细胞凋亡。
04
干细胞治疗T2DM的临床研究
在基础研究的基础上，研究者也对部分2型糖尿病患者进行了临床观察 [2]，共纳入12例男性T2DM，年龄55~65岁，病程＞10年，服用磺脲类、二甲双胍联合预混或基础胰岛素类似物治疗并维持稳定至少6个月，并进一步加用GLP-1受体激动剂利拉鲁肽治疗6个月后，血糖仍控制不达标。受试者分为两组：A组（n=6）为利拉鲁肽联合HUC-MSCs假移植组；B组（n=6）为利拉鲁肽联合HUC-MSCs移植组，随访观察24周，结果显示，HUC-MSCs对T2DM患者的糖代谢和胰岛功能有显著改善作用。
05
干细胞治疗糖尿病的前景 [4]
干细胞针对糖尿病发病的核心——胰岛功能细胞。实体器官胰腺移植或胰岛移植，理论上可实现胰岛结构恢复和代谢功能，但由于胰岛组织的来源有限、手术创伤大、术后并发症、免疫排斥等一系列问题，难以作为糖尿病治疗的常规手段。干细胞来源的胰岛素分泌细胞可创造无限数量的β细胞替代，适合于广泛应用，实现治愈糖尿病目的，是目前糖尿病研究领域的热点和重点。但干细胞治疗糖尿病的关键技术和核心问题仍有待深入研究和克服。
06
干细胞治疗糖尿病的挑战
胰岛细胞治疗中存在的免疫问题；
如何保证稳定的细胞来源和足够的移植细胞量；
如何获得维持细胞活性的细胞保存技术；
如何保证干细胞移植治疗的安全性；
如何有效提高干细胞治疗的治疗效果，急需寻找安全、有效的方式克服以上问题。
什么是外泌体?
01
外泌体概述
细胞外囊泡是机体远距离细胞间交流的一种手段，目前主要被分为3大类：外泌体、微囊泡和凋亡小体，临床研究中主要关注的是外泌体（图1）。外泌体是一种直径为25~200nm的纳米级脂质包裹体结构，富含RNA和蛋白质。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现。1987年，Johnstone将其命名为"exosome"，外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，之后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质，来源于不同组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白分子，还包含其行使功能的关键分子 [5]。
图1. 外泌体形成及组成示意图
02
干细胞外泌体
干细胞外泌体，是一种能被大多数干细胞分泌的微小囊泡，外泌体通过胞吐作用从干细胞中释放，复杂的混合因子能作为信号分子传递给其他细胞，从而改变其他细胞的功能；外泌体是干细胞旁分泌作用的主要介质，它们的内容物包含mRNA、microRNA、各种抗凋亡和促血管生成因子等；外泌体被包裹在坚硬的双层膜中，双层膜保护外泌体的内容物，使外泌体能够在组织中长距离移动。干细胞外泌体因在组织中的增殖、迁移、再生和炎症等方面的作用，有望成为“无细胞的细胞治疗”工具。
03
干细胞外泌体发挥生物学效应的方式 [6]
直接作用： 外泌体表面的蛋白分子或脂质配体直接激活靶细胞表面的受体，产生信号复合体并激活胞内信号通路；
递送作用： 外泌体可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进入细胞，将自身携带的蛋白质、核酸、脂质等活性分子带到细胞内，进而调控细胞的功能及生物学行为。
04
干细胞外泌体的分离方法 [6]:
超速离心法（最标准、常用）：包括100000G超速离心法和连续梯度蔗糖密度梯度离心法两种。100000G超速离心法的优势是简单实用，劣势是样本小、反复高速离心导致外泌体破裂影响质量；连续梯度蔗糖密度梯度离心法的优势是所获外泌体纯度高，劣势是难以去除高密度化学物，不适合临床应用。
超滤法：用孔径小于100nm的超滤膜低速离心分离得到外泌体。优势：快速；劣势：超滤时施加的压力大，导致体积大的囊泡变形和破裂。
异性蛋白的抗体分离法：优势：特异性高、精准分离；劣势：技术难度大。
聚合物沉淀法：基于聚乙二醇（PEG6000）等聚合物沉淀的方法。
声流体装置分离法：将微流控技术和声学结合，首先，利用较低频率声波去除血液中尺寸较大的红细胞、白细胞以及血小板等；然后采用较高频率的声波将外泌体与细胞外囊泡亚组成分（凋亡小体、较大的细胞外囊泡等）进行分离，并在通道的指定出口对外泌体进行收集。
05
干细胞外泌体VS干细胞：干细胞外泌体与干细胞相比具有诸多优势 [7]
效果好：可直接与靶细胞发生融合进而发挥生物学效应，作用效率更高；
性质更稳定：外泌体可保护其内容物免于降解，从而防止某些活性成分快速降解；
保存运输更方便：外泌体在-20°C下储存6个月、-80°C长期保存，同时不会损失其生化活性；
可量产：外泌体可在培养基内大量富集；
可控制：外泌体功能可通过改变细胞环境来改变；没有移植细胞带来的免疫排斥反应和肿瘤形成的风险；
免疫原性低：外泌体比细胞具有更低的免疫原性，更容易地开发“货架”产品。
干细胞外泌体治疗糖尿病及并发症的机制及应用
01
干细胞外泌体治疗糖尿病的细胞研究
研究表明 [8]，间充质干细胞（MSC）外泌体可促进低氧条件下的小鼠胰岛内皮细胞血管生成，其机制可能是通过上调 HIF1-α，调节 VEGF 表达，激活 mTOR 信号通路，促进胰岛内皮细胞血管生成。另一项研究表明 [9]，利用hucMSC-ex来减轻HFD和STZ诱导的T2DM大鼠模型具有可行性和有效性；静脉输注人脐带间质干细胞来源的外泌体（hucMSC-ex）可以通过增强外周器官胰岛素敏感性和减轻胰岛破坏来降低T2DM大鼠的血糖水平；hucMSC-ex可以通过促进肌肉中GLUT4的表达和膜转运以及依赖于胰岛素的肝糖原储存来恢复T2DM的葡萄糖稳态；hucMSC-ex通过抑制β细胞凋亡来缓解T2DM中的胰岛素分泌功能障碍。
02
干细胞外泌体治疗糖尿病的机制
目前已发现干细胞来源外泌体可用于修复或预防糖尿病造成的损伤，其免疫调节和修复特性可以保护甚至恢复早期糖尿病患者的原始胰岛免受自身免疫破坏，并且可能抑制胰岛移植的排斥反应。MSC外泌体可以通过多种渠道在T2DM中发挥作用（图2）。
图2.人体充质干细胞来源外泌体对2型糖尿病的作用示意图
03
干细胞外泌体治疗糖尿病慢性皮肤创伤
皮肤创伤是糖尿病常见的并发症，会使肌肤屏障受损。近年来的研究表明，干细胞在再生医学中具有巨大的治疗潜力，通过分泌抗炎、抗纤维化和促血管生成活性的因子，如可溶性分子（生长因子、细胞因子）或细胞外囊泡（微粒子、外泌体）等来改善创面愈合过程，尤其是干细胞外泌体，表现出强大的皮肤修复作用。一项探究尿源性干细胞外泌体对链脲菌素诱导的糖尿病小鼠的伤口愈合影响的研究 [10]表明, 人尿源干细胞释放外泌体携带DMBT1通过促进血管生成来促进糖尿病性创伤修复。另一项研究表明 [11]，来自MSC外泌体可以加速真皮成纤维细胞和角质形成细胞的迁移和增殖，并激活AKT通路，改善皮肤细胞（如成纤维细胞和角质形成细胞）的迁移和增殖。
04
干细胞外泌体治疗糖尿病足
以糖尿病足为代表的糖尿病慢性创面并发症是最严重、花费最多、致死致残率最高的糖尿病慢性并发症之一。传统治疗方案如局部清创换药、负压创面治疗、经皮腔内血管成形术等存在治疗效果欠佳、治疗适应证狭窄等缺陷，导致我国目前糖尿病足病的治疗存在保肢率低、治疗时间长、花费高等一系列亟需解决的问题。因此，如何促进糖尿病慢性创面愈合、降低截肢率、提高患者生存率已经成为国内外学者共同的研究目标。研究表明 [12]，脂多糖预处理的MSC衍生的外泌体可促进糖尿病皮肤伤口的愈合。MSC外泌体在糖尿病创面愈合以及糖尿病足中的作用机制如下图所示（图3）。
图3. MSC外泌体在糖尿病创面愈合以及糖尿病足中的作用机制
05
干细胞外泌体治疗糖尿病肾病
糖尿病肾病或慢性肾脏疾病是糖尿病最常见的并发症之一，干细胞在T2DM大鼠模型的肾损伤中均可起到有效的肾脏保护作用，表现为输注干细胞后，血肌酐、尿素氮以及尿微量白蛋白/ 肌酐降低，肾小球硬化和肾脏纤维化等病理改变均有一定程度缓解，但具体作用机制尚未明确，目前研究发现可能的机制包括 [13]：促进新生血管形成、营养作用、免疫调节、抗氧化应激、抗炎、抗氧化应激等。
06
干细胞外泌体治疗糖尿病心血管疾病 [14~15]
外泌体被证明是有效的生物信号传递者，涉及正常心脏生理以及疾病中控制心脏功能的多个过程。干细胞外泌体的心脏保护机制为研究热点，干细胞外泌体具有与干细胞相似的心脏保护功能。MSC外泌体能显著提高心肌细胞的存活率、并能抗心肌细胞损伤、促进新生血管形成、改善心脏功能，其机制可能与抑制TGF-β1/Smad2信号通路有关。干细胞外泌体具有较好的稳定性，较少引起受体细胞的突变以及免疫排斥反应，有望成为治疗糖尿病心血管疾病的有效方法。
此外，干细胞外泌体还在糖尿病并发症其他领域（如：糖尿病神经系统并发症、阿尔茨海默病等）进行着相关研究。
干细胞外泌体治疗糖尿病及其并发症的展望
01
干细胞外泌体临床研究广泛
目前已有关于干细胞外泌体治疗疾病的相关研究包括：2型糖尿病、炎性肠病、皮肤伤口愈合、肾脏疾病、肝脏疾病、移植物抗宿主病等十多种疾病。常见疾病的前景及机制如（图4）。截止于2021年1月， 干细胞外泌体治疗共有16项注册临床试验 [16]，包括自身免疫性疾病（4项）、心血管疾病（1项）、皮肤伤口愈合（2项）、神经系统疾病（3项）、肿瘤（1项）、COVID-19（5项）。
图4.外泌体临床应用前景及相关机制
02
干细胞外泌体在糖尿病及其并发症的应用前景及挑战并存
前景： 糖尿病及其并发症的治疗中，外泌体可以避免干细胞治疗的一些缺陷（免疫排斥、伦理问题等），并且外泌体具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用以及向损伤处聚集等优势。外泌体因包含多种蛋白和RNA，与某种单一的细胞因子相比，具有较高的安全性和更大的组织再生潜能，因此，干细胞外泌体在糖尿病及其并发症的治疗中具有极大优势。
挑战： 外泌体的提取方法及其复杂的分类系统阻碍了它的应用，外泌体高效提存技术成为临床应用前的有待解决的重要问题。动物实验局部注射干细胞外泌体后损伤处外泌体的浓度未知，外泌体促进胰腺或其他组织再生或者免疫调节时的最佳浓度、半衰期需要更深入的研究。由不同细胞或者同一细胞不同生理状态下分泌的外泌体可能存在差异，外泌体发挥作用的内容物及机制有待进一步探索。外泌体转运多种生物分子，如何在体内调节受体细胞、改变细胞的具体机制尚未阐明，需要进一步的深入探索及研究。
总结
糖尿病发病率不断攀升，糖尿病并发症也逐年增加。相信随着研究的不断深入和临床技术的不断成熟，未来干细胞外泌体在治疗糖尿病并发症的作用会被更加广泛的证实，成为糖尿病并发症治疗的又一武器。
专家简介
徐向进
教授，博士研究生导师
中国人民解放军联勤保障部队第900医院内分泌科主任医师
中华医学会糖尿病学分会常委
中华医学会糖尿病学分会糖尿病胰岛调控与再生医学学组组长
全军内分泌专业委员会副主任委员
福建省医学会糖尿病学分会主任委员
福建省医师协会内分泌代谢科医师分会副主任委员
福建省医学会内分泌学分会常委
《中华内科杂志》、《中华糖尿病杂志》、 《 中 华内分 泌代谢杂志》《国际内分泌代谢杂志》等杂志编委和通信编委
参考文献
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1.Gulnick AD, Ambruzs DM.Stem Cells Transl Med. 2015; 4:1214–1222.
2.徐向进，陈频，中华内分泌代谢杂志，2016 ,12 (32)：1003-1009.
3.XJ X，Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 2019.
4.Kandaswamy R, Stock PG. Am J Transplant.2018;18(Suppl 1):114-171.
6.Siqi Yin,et al. Am J Transl Res. 2019 Mar 15;11(3):1230-1240
7.Riazifar M,et al.Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2017 Jan 6;57:125-154.
8.陈津，中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2018, 8(004):212-217.
10.Chen Chun-Yuan, et al. Theranostics, 2018, 8: 1607-1623。
11.Zhao Bin,et al.J Mol Histol, 2017, 48: 121-132.
12.Ti Dongdong,et al. J Transl Med, 2015, 13: 308.
13.Liu Dongwei,et al. Cell Death Dis, 2020, 11: 1000.
14.Nazari-Shafti,et al. Stem Cells Transl Med, 2020, 9: 1558-1569.
15.Lin Yuan, et al. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2019, 65: 123-126
16.Lee Byung-Chul,Kang Insung,Yu Kyung-Rok.J Clin Med, 2021, 10.
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（来源：《国际糖尿病》编辑部）