Science丨免疫系统筛选是抑癌基因失活的主要驱动因素（二）

撰文：珍奇

IF：47.73

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亮点：

本研究利用同基因肿瘤模型在体外进行基于 CRISPR 的遗传筛选，并在免疫激活（野生型）和免疫受损（Rag1null 或严重联合免疫缺陷）小鼠中进行体内肿瘤移植。研究发现，适应性免疫系统特异性命中与人类肿瘤中最常突变的基因之间存在明显的重叠。

在肿瘤形成过程中，肿瘤必须进化以逃避免疫系统，并破坏有关抗原处理和表达或上调抑制性免疫检查点基因。2021年9月17日，哈佛大学Stephen J. Elledge团队于《Science》杂志上发表了一篇名为“The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation”的文章。他们发现癌症中反复突变的克隆选择主要受肿瘤避免自适应免疫系统的要求驱动。

肿瘤的起源是一个复杂的增生过程，涉及许多细胞功能的改变，包括细胞分化状态、端粒的维持、细胞增殖控制、适应改变的营养状态、血管生成能力的进化、避免细胞死亡以及适应蛋白质组和基因组应激因素。这些变化被称为生长和生存适应（GSA），让肿瘤摆脱组织平衡的正常约束，并演变成一个相对独立组织，形成新的规则和属性。癌症驱动基因的鉴定传统上沿着两条主要途径进行。第一种是基因和生化分析，研究病毒雌激素或病毒插入激活的基因。第二个涉及反复突变的识别，包括家族癌症综合征和散发性癌症。现代分析技术通过简化了这些方法并提供了详尽的潜在驱动因素列表。然而，目前有关这些基因功能驱动癌症的解释却已经落后。除了肿瘤形成过程中的 GSA 之外，还有另一个主要障碍需要克服，即免疫系统。免疫系统将肿瘤视为一种新兴的病原体，并释放出旨在消除肿瘤的反应，从而导致免疫监测适应（ISA）的改变。

本研究中，研究者使用4T1 乳腺肿瘤细胞在同基因小鼠中进行了 CRISPR 筛选。经过选择，细胞同时在体外培养 10 次群体倍增(PD) 或作为免疫活性 (WT) 或 SCID BALB/c 小鼠的皮下肿瘤移植。SCID 小鼠中的筛选结果确定了已知生长调节基因的富集，并在 WT 基因列表中确定了 B2m 和 Jak1，它们是抗原呈递和免疫信号传导的已知调节因子，验证了筛选的质量。在体内进行筛选时，存在适应性免疫系统的情况下具有更好的性能。使用 0.1 的FDR 截止值对显示阳性选择的基因进行分析显示，与 WT 小鼠的预期值相比，观察到的TSG 富集几乎是 9.5 倍，在体外和SCID 环境中发生的富集要小得多。接着，他们将他们在每个筛选臂中的命中率与在不同人类癌症类型（包括乳腺癌 (BRCA) 和泛癌样本）中观察到的突变模式进行了比较。与其他筛选条件相比，他们发现TCGA 中具有增强突变频率的基因与在 WT 小鼠中进行的筛选中的基因评分之间具有更强的相关性。

为了排除细胞类型特异性影响，他们使用相同的 CRISPR 文库对 CT26 细胞（一种致癌物诱导的小鼠结肠肿瘤细胞系）中的可成药基因进行了类似的筛选。随后对阳性选择FDR 截止值为 0.1 的基因的分析显示，与预期值相比，WT 小鼠中观察到的TSG 富集几乎是 12 倍，在体外分析或SCID 中看到的富集要小得多。与其他筛选条件相比，他们再次发现与人类肿瘤突变数据与在 WT 小鼠中进行的筛选在统计学上更强的相关性。

为了验证这些候选者，他们生成了一个切割控制 CRISPR 文库，其靶向约 4000 个表达基因的内含子，并混合在四个针对Gna13 的sgRNA 中，这些sgRNA 不存在于他们的原始筛选文库中。细胞在体外生长或作为皮下肿瘤移植物在 BALB/c WT 或SCID小鼠中生长。每个Gna13 靶向sgRNA 表现出GNA13 蛋白的减少。PDs 后sgRNA丰度的分析，还表明GNA13 耗竭对体外增殖没有影响。四种靶向Gna13 的sgRNA 中的每一种都具有相当的性能，并且在所有条件下都观察到了类似的阴性对照分布。

由于他们的可成药的 CRISPR 文库不包含许多已知的TSG，因此他们设计了一个小鼠 CRISPR 文库，针对一组更全面的已知在人类肿瘤中发生突变的TSG。他们使用这个TSG 文库转导了来自不同 C57BL/6 小鼠模型的三种不同的肿瘤细胞系，包括约 3000 个切割对照，并将细胞移植到 WT 或适应性免疫缺陷Rag1null 小鼠中。在WT小鼠中效果更为明显的是B2m和Hdac2，这些基因也在CT26和4T1筛选测试结果中观察到。

为了了解GNA13 如何调节其适应性免疫特异性肿瘤抑制剂活性，他们生成了GNA13 表达中缺乏的 CT26 细胞，将这些细胞植入WT小鼠的皮下肿瘤或在体外生长，并使用RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析。首先，他们比较了GNA13 缺陷细胞与表达对照sgRNA 的细胞的体外转录组。在Gna13 sgRNA 表达时过度表达的顶级基因是趋化因子Ccl2/MCP-1，这是一种已知的肿瘤微环境调节剂。使用两个Gna13 sgRNA，他们验证了GNA13 的缺失导致 Ccl2 表达升高，这导致CCL2 分泌增加。

为了检查GNA13 缺陷肿瘤增强的CCL2 分泌是否增加支持肿瘤巨噬细胞以影响肿瘤生长，他们生成了GNA13 缺陷细胞，这些细胞可以前压控制或Ccl2 sgRNA。相比之下，他们发现GNA13 缺陷肿瘤的生长增强取决于巨噬细胞的存在。对来自这些脂质体治疗肿瘤的免疫浸润的检查显示，氯膦酸盐治疗后总肿瘤巨噬细胞和 CD206 巨噬细胞群均减少。这些结果支持GNA13 的肿瘤抑制功能，通过其对CCL2 表达和分泌的负调节，可以调节促肿瘤巨噬细胞肿瘤浸润或极化，并建议通过抗体或小GNA13 缺陷肿瘤中CCL2 或其受体的分子干扰。

人体内，肿瘤生长于复杂的微环境，它由肿瘤细胞与频闪细胞、免疫细胞和血管作用组成。随着时间的推移，动态进化肿瘤受到来自免疫系统的压力。大多数癌症表型的体外基因筛选都忽略了这种生物学。在这项研究中，研究者着手捕捉这种缺失，同时在细胞培养的小鼠肿瘤细胞、具有完整自适应免疫系统的同步小鼠和缺乏适应性免疫力的同步小鼠中执行基因筛选。这种设计使其能够识别需要ISA或GSA突变的基因集。

教授介绍： Stephen Elledge，美国遗传学家和癌症研究员，哈佛医学院教授。曾于麻省理工学院获博士学位。他的研究重点是真核细胞DNA损伤反应的遗传和分子机制。他是美国国家科学院院士，自1993年以来一直是霍华德·休斯医学研究所研究员。2013年获盖尔德纳国际奖。

参考文献：

Martin TD, Patel RS, CookDR, Choi MY, Patil A, Liang AC, Li MZ, Haigis KM, Elledge SJ. Theadaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor geneinactivation. Science.2021 Sep 17;373(6561):1327-1335. doi: 10.1126/science.abg5784. Epub 2021 Sep16. PMID: 34529489.