Science Advances：脑跨膜蛋白质组的多区域分析揭示了抑郁症的新调节因子
跨膜蛋白在介导大脑中的突触传递、可塑性和体内平衡方面起着至关重要的作用。
细胞表面跨膜蛋白主要由G蛋白偶联受体（GPCR），离子通道和转运蛋白构成，在大脑的神经元信号处理和可塑性中发挥重要作用。他们的许多家族成员，尤其是GPCR，代表了中枢神经系统 (CNS) 疾病分子治疗最成功的目标。
然而，由于这些跨膜蛋白具有很强的疏水性、相对较低的丰度和快速的更新，因此使用传统的蛋白质组学技术进行测量尤其具有挑战性。
在此背景下，来自上海科技大学iHuman研究所的水雯箐课题组与胡霁课题组和钟桂生课题组合作，于2021年7月21日在Science Advances上发文，通过一种新的蛋白质组学方法揭示了小鼠抑郁模型大脑中的跨膜蛋白质组重构景观，并鉴定了两个以前未知的抑郁样行为的 GPCR调节因子。
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作者收集了10个成年小鼠大脑核团分析脑中的跨膜蛋白表达。首先进行细胞膜分离以减少丰富的胞质蛋白并富集跨膜蛋白，并使用单次数据非依赖性采集（DIA）质谱分析来自单个大脑区域的蛋白质消化物。
鉴于使用传统蛋白质组学技术绘制GPCR具有挑战性，作者使用深度学习模型创建了一个GPCR家族靶向杂交文库（简称GPCR杂交文库），其中包含在小鼠基因组中编码的524个GPCR的完整补充。
使用GPCR杂交文库每个区域平均鉴定了108个GPCR蛋白质，而传统的DDA文库仅鉴定了平均65个GPCR蛋白质。除了GPCR外，跨膜蛋白质组分析鉴定并量化了10个大脑区域的170个离子通道和176个转运蛋白。
图1 小鼠大脑不同区域的跨膜蛋白质组分析
2.跨膜蛋白转录组和蛋白质组谱的比较
跨膜蛋白质组分析能够全面了解小鼠不同大脑区域的跨膜蛋白表达，可以将其与转录组水平的区域解析基因表达进行比较。主成分分析(PCA)和基于对所有跨膜蛋白定量的分层聚类树揭示了四个大脑区域集群：脑桥/髓质、脊髓/中脑、大脑皮层/纹状体/丘脑和嗅球/海马(HIP)/小脑。
相比之下，跨膜蛋白编码基因的转录组图谱显示不同脑区的连接模式，大脑皮层/HIP/杏仁核聚集得更紧密，小脑作为异常值脱颖而出。
在RNA-seq和蛋白质组学数据之间共享的1738个跨膜蛋白编码基因（中值Spearman相关系数，0.39）中观察到mRNA和蛋白质丰度之间的适度相关性。GPCR和转运蛋白家族成员的mRNA与蛋白质的相关性低于离子通道。
结果表明，基于DIA MS的蛋白质组分析提供了跨膜蛋白分布的高通量和准确测量，在许多情况下，这在很大程度上与转录本分布不一致。
图2 小鼠大脑中GPCR、离子通道和转运蛋白家族成员的深度蛋白质组覆盖率和可重复量化
3.富含GPCR和其他跨膜蛋白的大脑区域
使用区域平均蛋白质组学量化数据，确定了区域性升高的 GPCR、离子通道和转运蛋白家族成员，这些成员分为三类：区域富集蛋白（丰度是所有其他大脑区域的两倍）、组-富集的蛋白质（两到四个大脑区域的丰度是所有其他区域的两倍）和增强的蛋白质（丰度是所有其他大脑区域中位数的两倍）。
在某些大脑区域中丰富的GPCR子集经历了异常明显的蛋白质合成、降解或运输调节。这以11个区域/组富集的GPCR为例，其mRNA与蛋白质呈负相关，包括来自趋化因子受体、肾上腺素能受体和神经肽Y受体家族的成员。
总之，这些富含GPCR的大脑区域的蛋白分布模式将为它们在大脑中的转录后调节和未表征的功能提供新的线索。
图3 跨膜蛋白编码基因在转录组和蛋白质组水平的多区域表达谱
基于作者的高准确度的跨膜蛋白质组分子图谱，进一步构建了120个GPCR与1159个跨膜蛋白质在脑组织中可能形成的内源性蛋白互作网络。以大麻素受体1(CB1)和亮氨酸的重复跨膜蛋白FLRT3为例，免疫染色同时观察到了海马神经元和HIP中CB1和FLRT3的共定位。
邻近连接试验(PLA)确认两种蛋白质在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和原代神经元中的紧密物理分布。免疫沉淀(IP)验证CB1和FLRT3在体外的相互作用。
图4 高度精确的共表达分析预测的GPCR和跨膜蛋白相互作用网络(PCC >0.9)
作者针对多重慢性压力诱导的抑郁模型（CUMS）构建了一个的最大DDA库和一个源自DIA MS数据的GPCR混合库，其中包含524个小鼠GPCR的完整补充。
从CUMS模型的每个大脑区域中的GPCR、离子通道和转运蛋白家族中鉴定了离散的差异表达(DE)跨膜蛋白集。根据PCA图，在PFC和HY中发现了数量最多的DE跨膜蛋白，这两个大脑区域对情绪调节和压力反应至关重要。
从CUMS模型的大脑蛋白质组分析中鉴定了来自三个家族的91个上调和142个下调的独特蛋白质，它揭示了与抑郁症发病机制相关的跨膜蛋白质组重构的最全面的景观。而传统的方法分析CUMS模型的整个小鼠大脑时，仅发现了16种异常调节的蛋白质。
在我们的研究中发现的这组233种DE跨膜蛋白富含13条通路，包括突触囊泡循环、尼古丁成瘾、氧化磷酸化、钙信号和腺苷3',5'-单磷酸(cAMP)信号，富含已知参与帕金森病和阿尔茨海默病发展的分子，这可能表明神经退行性疾病和抑郁症之间存在共同的分子机制。
图5 抑郁症CUMS模型中小鼠大脑的跨膜蛋白质组分析
通过体内药物干预和/或基因操作发现35种GPCR显示在PFC，HIP或HY显著差异表达，这三个脑区都与情绪和抑郁症相关，且这三个脑区中19种GPCR已被文献证明是抑郁样行为的公开调节因子，是潜在的抗抑郁靶点。
作者选择了NmbR和Fzd7这两个未验证与抑郁症有关的GPCR进行功能评估。通过行为学和药理学实验，验证了NmbR和Fzd7具有快速抗抑郁反应。
图6 从抑郁模型三个特定脑区中发现的差异表达GPCR及其与抑郁行为的关联
图7 小鼠模型中抑郁样行为的新型GPCR调节因子的发现
综上，本文开发了一种新的技术来表征脑组织中跨膜蛋白质组的区域分布和动态。当这项技术应用于疾病模型并与体内药理学相结合时，可以非常有效地发现驱动疾病表型的分子调节剂。
上海科技大学iHuman研究所水雯箐课题组研究助理李珊珊、生命科学与技术学院博士研究生罗火青、娄容珲与iHuman研究所成像平台田翠萍为本文共同第一作者，水雯箐教授、胡霁教授、钟桂生教授为共同通讯作者，上海科技大学为第一完成单位。该工作也得到上科大徐菲课题组与中科院生物与化学交叉中心张耀阳课题组的参与和支持。
Li S, Luo H, Lou R, et al. Multiregional profiling of the brain transmembrane proteome uncovers novel regulators of depression. Science advances 2021; 7(30). DOI: 10.1126/sciadv.abf0634