二代基因检测技术助力发现弥漫型胃癌驱动基因案例分析
陆元志教授
单位：暨南大学附属第一医院病理科。
学历+导师：博士、美国俄亥俄州立 大学博士后、高级研究员。博士研究生及博士后导师。
职 务：病理科副主任，精准医学中心副主任。
专业特长：从事病理学医、教、研工作30年，从事肿瘤病理及分子病理诊断，擅长肿瘤用药NGS检测报告解读，指导肿瘤精准诊疗。为暨南大学附属第一医院肿瘤多学科诊疗（MDT）专家组成员；广东省“扬帆计划”引进紧缺拔尖人才、暨南大学第四层次人才。长期从事分子病理学与分子肿瘤学前沿研究及肿瘤诊断新技术应用与推广，近年来在The Journal of clinical investigation（JCI）和Developmental Cell，Cancer Res等国际著名专业期刊发表研究成果。目前承担国家自然基金面上项目两项，主要研究领域是乳腺癌基因组变异及其微环境共进化分子调控网络、临床新药靶点及新抗原筛选。
学术任职：中国抗癌协会肿瘤标志物委员会委员；中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会乳腺肿瘤病理学组委员；中国医药生物技术协会分子诊断专业学组委员；中国中西医结合协会分子诊断专业委员会委员；中国民族医药学会精准医学分会委员；广东省医师协会病理科医师分会委员；广东省抗癌协会肿瘤病理专业委员；广东省免疫学会第五届理事会理事；广东省精准医学应用学会乳腺肿瘤分会委员，广东省精准医学应用学会免疫治疗分会常委。
驱动基因，是与癌症发生发展相关的重要基因，找到驱动基因后癌症的治疗就事半功倍。目前驱动基因比较成熟的是非小细胞肺癌，其驱动基因包括EGFR，ALK，ROS1等，使用对应的靶向药可以实现肿瘤的长期生存。但是，目前很多肿瘤无法找到准确驱动基因，导致无法精准诊断。因此，找到每位肿瘤患者的驱动基因及有效治疗靶点才是临床研究者追求的目标。
今天病理大咖 陆元志教授给大家分析一下在NGS助力下发现弥漫型胃癌驱动基因的病例分析。
这是颇费周折寻找胃癌驱动基因的案例，基因检测过程简要小结如下
一、简要病史
患者，女性，52岁
2019年7月16日胃镜检查，病理结果为胃低分化腺癌。
2019年7月23日在某三甲医院进行全胃切除手术。术后病理：胃低分化腺癌，部分粘液腺癌，溃疡型，Laurens分型为混合型。
2019年8月23日开始化疗。化疗方案：奥沙利铂＋替吉奥，辅助用药为维生素C，维生素B6，法莫替丁，地塞米松磷酸钠，盐酸托烷司琼，肌苷针等。化疗期间呕吐、恶心反应明显。目前两次影像学评估结果病情尚属稳定。
以上病理诊断结果较为明确，属于低分化腺癌，部分为黏液癌，为Laurens分型中的混合型，即癌细胞弥漫浸润于胃壁肌组织中但伴有部分腺样结构，腹腔内多组淋巴结伴转移病变，提示是一类预后较差的胃癌。免疫组化EGFR阳性，ERBB2阴性。
二、患者基因检测过程及结果
第一次基因检测：患者家属于2019年8月以手术标本送和瑞基因进行全外显子组测序，结果小结如下。图1可以看出，通过全外显子组测序（WES），发现了120个非同义突变基因，肿瘤突变负荷低，为2.92/Mb，同时患者癌组织PD-L1阴性表达，微卫星稳定型（MSS）。图3.显示检测公司特别关注的几个突变基因，但丰度不高（10%左右)，没有发现插入缺失、融合或扩增基因。很显然，这些被关注的基因也不是真正的驱动基因，无直接的药物靶点。
图2. 第一次基因检测结果小结
图3. 第一次NGS结果中被重点关注的基因
图4. 肿瘤新抗原预测结果
为了探究以上结果的真实性，挖掘这次WES结果中的可能线索，我让患者家属向检测公司申请给予120个基因突变的原始数据列表，经过逐一阅读分析每个突变基因的功能，并进行归类整理，厘清这些突变基因驱动信号在胃癌中的作用。最终发现：这次WES结果中的SNV确实不能直接驱动肿瘤的恶性演进（图4）。至此，这次检测似乎失去了NGS应有的价值，但这一现象与这例胃癌的高度恶性表型差异极大！可以肯定的是，形态学上已表现出极度恶性表型的癌细胞会存在背后的重要驱动力量！因此，这个差异性至少带来以下两个疑问：1、患者NGS检测前的样本质控是否做好？2、根据TCGA大数据和本例胃癌的病理形态特征，患者病变是否是罕见融合基因所致？
图5. 第一次WES部分突变基因列表
带着以上两个疑问，我首先让患者家属从当地医院病理科借出所有病理切片包括免疫组化结果进行再次会诊观察，发现肿瘤细胞确实是弥漫分布于胃壁组织中，局部见黏液湖形成和印戒细胞（图6）。病理结果提示：在做NGS检测前，如不进行癌细胞富集，减少正常组织干扰，检测结果将难以反映患者病变的真实基因组变异信息。
图6. 患者弥漫型胃癌的镜下特点（胃的黏膜下层、肌层及浆膜可见低分化癌细胞弥漫分布，见黏液湖形成和印戒细胞）
针对这个病变特点，经过充分沟通后，患者家属同意重新质控标本并富集癌细胞，再次做NGS检测。重新切25张切片后，以人工方式简单去除可能包含癌细胞较少且正常组织较多的组织部分，避开黏液湖部分，以尽量富集癌细胞。患者家属经多方咨询了解后，将重新质控后的样本送给北京泛生子公司做WES外加大panel和几百个融合基因panel检测，结果小结如下（图7-10）。
图7.第二次基因检测结果小结
图8. 第二次基因检测部分基因列表
图9. 第二次基因检测部分基因列表与解读
总体上，第二次WES检测结果与第一次结果较为相似，即SNV也没有一个真正意义上的驱动基因，同样是低TMB和MSS，在WES中未发现基因重排或扩增，两次基因检测大部分突变基因重复性较好。不同之处是，第二次检测出的突变基因数为71个，丰度相对较高，提示样本重新质控与癌细胞富集达到一定效果。此外，第二次检测出PTCH2的胚系杂合型缺失。两次WES结果提示患者病变基因组相对稳定，这也和TCGA数据及病理形态较为吻合。
但更重要的是，第二次扩大检测的几百个融合基因中发现了一个融合基因：即CLDN18->ARHGAP26，融合序列为TACGATGGAGGTGCCCGCACAGAGGACGAG@gtctacaactcgaacaaagacagccagagt，两断点间有36bp插入。这个发现与目前TCGA等胃癌基因组大数据的结果高度一致。因此，可以确定，这个CLDN18->ARHGAP26融合是本患者最重要的驱动基因。当然，参与调控表观遗传学相关的基因SMARCA4致病突变亦参与癌的演化过程，尤其是化疗耐药。
三、关于胃癌基因组学研究进展
以上患者基因检测发现的融合基因是否是病变发展的驱动力量？为进一步确认这个融合基因的作用，我们首先看看TCGA大数据结果。事实上，2014和2015年，癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）和亚洲癌症研究组织（Asian Cancer Research Group, ACRG）就分别通过多组学平台对胃癌进行综合分析，提出了胃癌分子分型模型。TCGA胃癌分子分型包括四个亚型（图11、12）：（1）EBV感染型：约占9%，好发于胃底和胃体，多见于男性。其特征包括PIK3CA频发突变（80%），其次是ARID1A（55%）和BCOR（23%）突变，但TP53突变罕见。另外CDKN2A（p16INK4A）启动子超甲基化和JAK2、CD274和PDCD1LG2扩增亦是这一亚型的分子特征，并极少伴H.pylori感染。（2）MSI型：约占22%，好发于胃窦或幽门，多见于高龄女性，其特征是MLH1启动子的超甲基化，存在高突变率基因，包括PIK3CA、ERBB3、ERBB2和EGFR突变等，但罕见BRAF V600E基因突变，同时此型患者常伴有I类组织相容性复合物基因B2M和HLA-B突变。（3）基因组稳定（GS）型：其中GS型约占20%，初诊患者年龄偏低（中位年龄59岁），组织学上多属于Lauren弥漫型胃癌（73%），有高频的CDH1突变（37%）、RHOA突变或RHO家族GTP酶活化蛋白基因融合现象（CLDN18-ARHGAP融合），RHOA突变能与多种效应因子如ROCK1、mDIA和PKN等调控细胞运动与粘附性，并激活下游STAT3信号通路，但RHOA突变与CLDN18-ARHGAP融合通常不同时存在（4）染色体不稳定（CIN）型：约占50%，胃食管交界处和贲门（65%）处胃癌多属于此型，为Lauren分型中的肠型。其具有标志性分子改变包括染色体异倍体和受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinases， RTKs）基因扩增，最常见是EGFR扩增，同时常伴有细胞周期调控基因（CCNE1、CCND1和CDK6）扩增。ACRG对300名胃癌患者进行多组学研究，发布了亚洲人胃癌的四种分子分型：（1）MSI型；（2）MSS/上皮间质转化（EMT）型：年轻患者多见，常为Lauren弥漫型（80%）且Ⅲ～Ⅳ期胃癌，预后最差，CDH1表达缺失是这一型胃癌的重要分子特征；（3）MSS/TP53（+）型：多数患者EBV阳性，伴有以下基因高频突变APC、ARID1A、KRAS、PIK3CA和SMAD4基因（4）MSS/TP53（-）型。常伴以下这些基因扩增：ERBB2、EGFR、CCNE1、CCND1、MDM2、ROBO2、GATA6和MYC。在ACRG和TCGA分型系统中，MSI型吻合度最大。在四个分子亚型的胃癌中，GS型或MSS/EMT型是预后最差的亚型（图12）
图11. TCGA胃癌分子分型与高频突变基因（Nature. 2014 Sep 11;513(7517):202-9）
图12.ACRG胃癌分子分型与预后关系（Nat Med. 2015 May;21(5):449-56）
可见，TCGA和ACRG的基因组数据在很大程度上亦反映了胃癌的病理形态特征及预后。在Lauren弥漫型胃癌中，除了CDH1（37%）和RHOA高频突变驱动外，CLDN18-ARHGAP融合是关键的驱动分子事件（图13）。这一数据提示：通过病理形态观察并整合癌基因组大数据可以为基因检测提供方向与线索。本患者两次WES检测都没能从SNV中发现有意义的驱动突变包括CDH1和RHOA突变，提示这类型胃癌组织基因组确实较为稳定（患者TMB低、MSS），但遗憾的是两次WES检测都没有捕捉到这个本来常见的融合，这个在很大程度上可能与现有检测范围有关，这也是本例患者根据病理形态改变最终决定要扩大融合检测的理由。
图13. CLDN18–ARHGAP26 融合是弥漫型胃癌的重要分子事件之一（Nature. 2014 ;513:202-9）
那么，CLDN18-ARHGAP融合如何驱动胃癌的演进？这里给出两篇主要参考文献（图14）。功能上，CLDN18是上皮细胞紧密连接处的关键分子，其与ARHGAP26 融合后所产生的融合蛋白将降低癌细胞粘附性，且促进此型胃癌患者对5-FU和奥沙利铂耐药，与患者不良预后有关。
图14.CLDN18–ARHGAP26 融合降低癌细胞粘附性和化疗耐药Cell Rep. 2015 Jul 14;12(2):272-85. Nat Commun. 2018 Jun 30;9(1):2447）
四、针对CLDN18-ARHGAP融合驱动胃癌的治疗策略
驱动基因找到并初步认识其作用机制后，那么如何干预又是另外大问题？首先看看目前关于胃癌的治疗指南，不论是NCCN指南或是我们国内指南共识，对于难治性的胃癌，都推荐氟尿嘧啶类化疗药加铂类化疗为基础的化疗方案。如2018年国家卫健委关于胃癌诊疗规范中做如下推荐：常用的系统化疗药物包括：5-氟尿嘧啶（5-FU）、卡培他滨、替吉奥、顺铂、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、白蛋白紫杉醇、伊立替康、表阿霉素等，靶向治疗药物包括：曲妥珠单抗、阿帕替尼。化疗方案包括2药联合或3药联合方案，2药方案包括：5-FU/LV+顺铂（FP）、卡培他滨+顺铂（XP）、替吉奥+顺铂（SP）、5-FU+奥沙利铂（FOLFOX）、卡培他滨+奥沙利铂（XELOX）、替吉奥+奥沙利铂（SOX）、卡培他滨+紫杉醇、卡培他滨+多西他赛、5-FU+伊立替康（FOLFIRI）等。
对HER2表达呈阳性（免疫组化染色呈+++，或免疫组化染色呈++且FISH检测呈阳性）的晚期胃癌患者，可考虑在化疗的基础上，联合使用分子靶向治疗药物曲妥珠单抗。既往2个化疗方案失败的晚期胃癌患者，身体状况良好情况下，可考虑单药阿帕替尼治疗。
事实上，这些推荐也基本参考了NCCN指南内容（图15）
图15. NCCN指南关于胃癌化疗推荐（2019.V2，部分内容）
然而，弥漫型型胃癌对这些通用的治疗方案反应效果不佳（图16）
图16. 弥漫型胃癌对化疗反应较差（Journal of Cancer 2018; 9(1): 81-91. Ann Surg Oncol ,2018); 25:3257–3263）
那么，针对CLDN18-ARHGAP融合基因驱动的胃癌，目前是否有更为有效的办法呢？
总体上，目前尚未有上市的靶向药物可以干预这个融合基因的驱动作用。但针对CLDN18.2 的单克隆抗体 Zolbetuximab (or IMAB362，唑培妥昔)已在临床试验中显示良好效果。该抗体是一种嵌合IgG1单抗，其与肿瘤细胞表面的CLDN18.2结合，通过抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性作用机制诱导癌细胞死亡；其联合化疗药表阿霉素、奥沙利铂和卡倍他滨等药物，能明显延长胃癌或胃食管结合部的腺癌（图17）。国内复旦大学中山医院等单位也正在参与这项全球性的III期临床试验。
图17. Zolbetuximab (or IMAB362，唑培妥昔)单抗联合化疗治疗CLDN18.2 阳性（2+、3+）胃癌和胃食管联合部腺癌临床试验结果（Annals of Oncology 30: 1487–1495, 2019）
此外，针对CLDN18.2的CAR-T一期临床试验也取得不错的效果（图18）。
图18.针对CLDN18.2的CAR-T一期临床试验
但这两个试验性用药都需要以现有的石蜡标本，用免疫组化检测癌组织中CLDN18.2表达水平。
五、关于NGS在肿瘤临床精准诊疗中的作用
很显然，这个案例提示NGS在肿瘤临床诊疗中已显示出强大的力量，如不依赖NGS技术，这个患者驱动基因的庐山真面目将很难以识别。NGS在临床肿瘤尤其是晚期或疑难肿瘤患者精准诊疗中的重要作用已是不争的事实，只是我们要知道如何使用这个武器？如何正确解读NGS技术平台所产生的结果？
结合这个案例，这里简谈 NGS在肿瘤精准诊疗中的应用及一些共性问题
1、检测前的专业咨询：主要弄清楚该不该做NGS？检测目的是什么（是为了解决用药或治疗反应或预后判断）？检测哪些基因？如何检测？拿到结果后如何再解读等等？
所谓专业咨询，即患者在检测前需要寻求既了解临床肿瘤学、病理和分子病理学、分子肿瘤学知识，又懂得分子遗传学、基因组学和简单生物信息学等跨学科知识的专家或专家团队（MDT）帮助。在明确肿瘤性质、病变特点、临床分期等基础上选择合适的样本与检测产品。产品选择时需要根据患者肿瘤特征，确认产品基因列表中能覆盖热点驱动基因或特殊变异形式（如特殊的融合），
一般而言，晚期癌症患者可以进行NGS大panel检测，这样的检测信息至少可以帮助明确药物靶点、免疫治疗相关标志物（如目前的TMB、MSI等）、基因群及其信号网络对化疗的可能影响（不是简单一对一关系）、复发与预后信息的大概预测（如癌干细胞克隆富集和表观遗传学改变）等等。
WES或RNA-seq或全基因组（WGS）检测一般是在大panel不能解决或驱动基因较分散且不固定的癌种如高级别三阴性乳腺癌（TNBC）可以使用，因为WES以上的测序其生信分析与临床解读极为困难，不是一般医生或公司解读人员能完成好。
关于肿瘤新抗原的预测，一般采用新鲜组织WES预测，RNA-seq验证来做，以目前的石蜡切片的大panel检测或WES来预测一般不准确。例如这个患者第一次WES也做了预测，但根本预测不到CLDN18.2这个抗原表位，而这个抗原是胃癌里已知的有效抗原（图4）。
2、检测前样本病理质控：这是不可缺少的重要环节，在手术离体样本正确处理前提下（如正确并及时固定），做好样本质控还涉及两个关键环节：（1）蜡块的正确选择，要确保蜡块组织中至少包括20%以上的癌细胞，避开出血与坏死区域；但对于穿刺小标本，至少也要保证含200个细胞以上。为保证NGS检测结果可靠性，切忌拿不经过病理确认的标本做基因检测，那样会增加检测风险和成本。（2）切片过程中防止人为污染，要使用新的一次性刀片切片，切片池的水亦需要更换新鲜水。
一般而言，首次做基因检测的患者，能用组织检测的都优先考虑组织检测；存档组织最好不要超过一年，以防DNA过度降解。实在拿不到组织情况下，可以考虑血液或其它与癌相关的体液检测，但对于治疗反应监测可以用血液检测，血液检测要以EDTA抗凝管抽血。对于胸腹水样本，亦可以通过离心富集癌细胞做成细胞蜡块后再切片送检。对于特殊肿瘤组织如像本案例那样包含很多黏液湖的黏液癌或弥漫分布的癌细胞的组织，在检测前需要进行癌细胞富集（人工或激光显微捕获等）。
3、检测中的质控：这部分工作是患者和医生都无法把控的环节，需要各检测单位严格按照国际和国家规范进行检测，做好全流程质控如各种试剂质控、样本病理再质控、DNA提取质控（含量、质量完整性）、文库构建质控、上机测序质控、对照样本质控、数据下机后质控及生信质控、报告规范性等等，目的是确保真正的驱动基因不被忽略掉。报告形式与内容上要充分体现重点变异信息突出、基本信息完整正确、驱动变异识别正确、用药推荐合理等。总体上要做到方便医生与患者阅读及信息检索。避免主次不分、添枝加叶干扰阅读。
4、NGS检测报告临床解读：可以说，NGS检测报告的临床再解读是实现NGS检测临床价值最关键的一步！很多人会问，检测公司报告都写得很清楚了，为什么还要重新解读报告？事实上， 除了简单的癌基因如EGFR、KRAS、BRAF、ALK、ROS1、MET、HER2等常见的癌基因激活和常见的抑癌基因灭活如TP53、PTEN、APC、STK11、RB、CDKN2A等容易被检测公司识别和解读外，其他类型突变的基因群如表观遗传学驱动等及其信号网络作用驱动肿瘤演化的信息，几乎被检测公司忽略掉，体现了检测公司不能正确识别驱动基因的作用，这样就难以准确推荐药物了。另外，在已知的驱动突变基因中可以是多种药物都可以使用，到底是先用哪个药，报告里一般不明确。再者，几乎所有的NGS检测报告对关键基因变异的解读仅仅是罗列信息，未能提供信息之间的关联分析和可靠结论。因此，拿到NGS报告后需要重新梳理驱动基因是否判读准确？用药推荐是否合理？意义未明的基因是否是真正的意义未明或起到关键驱动作用？要综合分析基因群变异及其信号网络是否对当前常规化疗方案可能产生影响？是否存在耐药复发的可能种子？用药的先后顺序如何安排等等？只有这样的临床再解读，NGS报告才能实现它的真正价值。
小结：本例患者在形态病理、分子病理及基因组学知识有机结合指导下，通过NGS技术手段寻找到了关键的驱动基因，当然患者癌组织中的其他突变如参与表观遗传学调控基因SMARCA4R973W（12%）的致病突变，亦参与癌的演化并可能影响到治疗效果，因为SMARCA4是SWI/SNF (SWItch/Sucrose Non-Fermentable)染色质重塑复合体中关键的ATP酶，其突变将改变整个基因组的转录过程（图19）。
图19. SMARCA4 R973W（12%）的致病突变及其功能
最后，祝愿这位患友早日康复，愿NGS技术造福更多患友，助力价值医疗！