CHO稳定细胞株背景介绍

哺乳动物细胞是生产重组治疗蛋白的主要宿主细胞，特别是一些需要复杂的翻译后修饰的重组蛋白。由于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞出色的翻译后修饰和工业可拓展性等使其成为最常用的用于重组蛋白工业生产的细胞系。

获得用于工业生产的高表达重组CHO（rCHO）细胞系的传统方法是通过重组蛋白基因（r-蛋白基因）的随机整合获得的，即通过选择性标记进行多轮筛选以获得具有高表达水平的克隆。而由于缺乏对随机整合插入位点的控制，部分克隆细胞系的重组蛋白生产力可能会随着时间的推移而减少，导致细胞系不稳定。因此，定点整合是一种很有前景的细胞株开发策略，可以提高开发效率。

目前已经有几种方法来实现外源基因到特定位点的整合。第一种是由特定位点介导的重组酶包括Flp/FRT、xb1、Cre/loxP和phiC31/R4整合酶。通常，这种方法需要建立细胞系平台以用于靶基因整合。第二种方案是通过工程化的核酸酶，如转录激活因子效应核酸酶（TALENs），锌指核酸酶（ZFNs）和CRISPR/Cas9。这些核酸酶在目标基因组位点可以诱导DNA双链断裂（DSB），将外源基因通过同源定向修复（HDR）插入DSB位置。与TALENs和ZFNs相比，CRISPR/Cas9技术更高效，可靠且成本更低。使用与CRISPRRNA（crRNA）融合的sgRNA（sgRNA）与crRNA结合，Cas9蛋白可以靶向切割靶DNA并在指定的基因座处诱导DSB，以将结合于质粒的同源臂通过HDR靶向整合特定定位点。CRISPR/Cas9已成功应用于在许多类型细胞系中插入靶基因的基础研究，包括CHO细胞。但是，这种策略的工业用途仍有待探究。

本研究中，我们尝试构建CRISPR/Cas9介导的特定位点整合策略以优化CHO细胞系的开发过程。由于缺乏关于高表达整合位点和稳定行的系统性研究，我们基于先前的报告选择了三个候选位点。第一个是8号染色体的端粒区域称为C12orf35。据报道位于端粒区附近的转基因是比其他类型的克隆更稳定和高效（李等，2016；Ritter等，2016）。第二个位点是HPRT，据报道，它是一个理想的整合位点可以产生高表达scFv-Fc的稳定CHO细胞系（Kawabe等2017；Wang等2017）。第三个是GRIK1，这是一个重新整合的位点，最近通过鉴定和重新定位发现的用于人类基因组中的转录热点（Cheng等，2016）。编码mCherry和anti-PD1单克隆抗体（mAb）用作模型蛋白插入在选定位点上进行进一步评估。最后，我们确定了C12orf35是获得具有一致的生产力和产品质量稳定的细胞系的最佳整合位点，并证明CRISPR/Cas9介导的位点特异性C12orf35的整合是一种可靠而有效的策略，可用于工业rCHO细胞系的开发。