科研 | Microbiome: 老年小鼠的粪菌移植可通过调节海马突触可塑性和神经传递相关蛋白影响年轻小鼠的空间学习记忆
编译：洛雪，编辑：Tracy、江舜尧。
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肠道菌群和脑肠轴是近年来的研究热点，但目前鲜有报道其可以直接影响认知功能，海马是中枢神经系统组成的一个重要结构，它的功能也易受年龄等因素的影响。本研究将老年小鼠的粪菌移植（FMT）到年轻小鼠，进一步研究FMT是否影响海马的功能。研究人员通过将老年小鼠的粪菌移植到年轻小鼠，移植后进行了一系列行为学实验及代谢组学和蛋白质组分析。结果表明，老年小鼠的粪菌移植使年轻小鼠的空间学习和记忆受损，而焦虑、探索行为和运动活动没有受到影响。这与海马中涉及突触可塑性和神经传递的蛋白质表达变化的结果符合。与短链脂肪酸(SCFAs)产生相关的细菌(毛螺菌属、粪杆菌、瘤胃菌)和中枢神经系统紊乱相关的细菌(普雷沃氏菌和瘤胃菌)的也明显减少。微生物菌群与年龄的变化对中枢神经系统蛋白质的表达和功能产生一定影响。本文的研究结果还揭示了肠脑轴在衰老中的重要意义，为通过使肠道菌群年轻化改善老年相关疾病的治疗方案设计提供了强有力的支持。
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实验设计
实验结果
1. 老年小鼠的粪菌移植使年轻小鼠的粪便微生物群落获得衰老表型
首先，作者研究了年轻(3月龄)和老年(24月龄)小鼠的粪便微生物群落组成（图1)。Alpha分析表明，3月龄小鼠和24月龄小鼠粪便微生物群落中的物种丰富度具有明显差异(P=0.0107)，与3月龄小鼠相比，老年鼠的粪便微生物群落含有更多不同的扩增序列变体(ASV)(图1A)。Beta多样性(Bray-Curtis)分析表明，3月龄小鼠和24月龄小鼠粪便微生物群落组成有明显差异(图1B)，与老年小鼠相比，成年小鼠中与Ruminiclostridium, Butyricicoccus,Lachnoclostridium, Lachnospiraceae spp., Shuttle-worthia,Marvinbryantia,相关的ASV显著增多，而与Staphylococcus, Jeotgalicoccus, Facklamia,Parvibacter, Enterorhabdus, Muribaculum, Parabacteroides, Anaerostipes相关的ASV显著减少。通过对粪便微生物组学和代谢组学数据进行分析，作者发现粪便短链脂肪酸(SCFA)的水平降低(图2)与专性厌氧菌(如乳螺科和反刍球菌科)的降低之间存在着关联(图3)。
图1 年轻小鼠和老年小鼠粪便微生物群落组成的比较
A.Alpha多样性分析,B.Beta多样性分,析C两组小鼠粪便微生物组成中不同菌属的相对丰度分析。
图2和图3 成年和老年小鼠粪便微生物组学和代谢组学数据的Person相关性热力图
接着，作者通过将老年小鼠的粪菌移植到年轻小鼠进行深入研究，首先进行动物分组(成年小鼠接受成年小鼠FMT，成年小鼠接受老年小鼠FMT)，移植后进行小鼠粪便微生物群落的分析。Alpha分析表明，两组小鼠的物种丰富度没有显著差异(图4A)。Bray-Curtis分析表明，FMT前和FMT后的粪便微生物群落组成发生明显变化，每组FMT后的样本与其FMT来源的粪便微生物群落聚集在一起(图4B)。接受FMT移植的两组小鼠的粪便微生物组成的差异并不像作者最初研究中看到的年轻和老年组之间的差异那么明显；只有4个微生物属(Prevoteaceae，Faecalibaculum，Lachnospiraceae和Rumodiccaceae)的水平在两组之间有显著差异(图4C)，而粪便微生物组和代谢组数据之间几乎没有明显的关联(图4D)
图4 FMT对成年小鼠粪便微生物组成的影响
A.Alpha多样性分析,B.Beta多样性分析MDS图,C.细菌菌属的相对丰度分析,D粪便微生物组学和代谢组学数据的Person相关性热力图。
2. 老年小鼠的粪菌移植使年轻小鼠的空间学习和记忆受损，而焦虑、探索行为和运动活动没有受到影响
接着，作者研究了年轻小鼠接受老年小鼠FMT后一系列行为学的变化。首先，作者通过使用Barnes测试来评估小鼠的空间学习记忆能力。接受老年小鼠微生物群移植的FMT-aged组平均初次潜伏期(41.7±3.5s)，显著高于未接受治疗的对照组(30.5±3.9s)，接受年轻小鼠微生物群移植的FMT-adult组(23.5±6.7s)(P<0.05)(图5A)。FMT-aged组小鼠在包含逃逸通道的目标象限(28.9±2.6s)比对照组(46.5±6.3s)和FMT-adult组(51.8±10.2s)花费的时间少(图5B；图5C中的热图)，证实了粪便微生物群落在空间学习和记忆中的重要作用。
作者接着通过新物体识别实验进一步评估学习和记忆能力，实验表明，两组小鼠在探索两个不同物体所花费的时间上有显著差异(图5D)。对照组小鼠(未接受治疗的对照组，接受年轻小鼠微生物群移植的FMT-adult组)，更喜欢探索新物体而不是熟悉的物体，而FMT-aged组小鼠探索新物体的时间与对照组相比显著减少(分别为0.23±0.04和0.46±0.05；P<0.01)，这表明记忆能力受损导致新物体识别能力降低，热图进一步证明了这一点(图5E)
图5 年轻鼠和老年鼠FMT对小鼠空间学习记忆的影响
A-C.Barnes迷宫实验，FMT-aged组小鼠的平均初级潜伏期(图3A)明显高于其他对照组。此外，在保持测试期间，与对照组相比，FMT-aged组小鼠在包含逃逸通道的目标象限花费的时间更少(图3B；图3C中的热图)。D-E.新物体识别实验。n=10~12。
有研究报道，微生物组成会影响动物模型中的运动活动和类似焦虑的行为。作者选择了旷场试演和高架十字迷宫实验评估这些行为表现。在旷场实验中，与未经治疗的对照组相比，FMT-aged组和FMT-adult组的总运动距离没有显著差异，表明这些动物的运动能力没有明显受损(图6A)，但FMT-aged组有偏爱旷场的外围或角落，而不是旷场中心的倾向(图6B)，代表的轨迹如图6C-E。在高架十字迷宫实验，与对照组相比，FMT-aged组小鼠的开臂活动时间和闭臂活动时间没有显著差异(图6F-G)。
图6 年轻鼠和老年鼠FMT对小鼠空间学习记忆的影响
A.旷场实验,总运动距离,B.旷场实验,中心运动时间,C-E.小鼠旷场运动代表性轨迹。F-G.高架十字迷宫实验
3. 老年小鼠的FMT影响年轻小鼠海马区的蛋白质表达
FMT对小鼠的行为学产生影响（如学习和记忆能力受损），为了阐明这一过程的分子机制，研究人员采用了非标记定量蛋白质组学方法，以海马体为目标，海马体是已知在学习和记忆中起重要作用的大脑区域，并随着时间的推进经历了几个变化。随后的蛋白质网络分析了在FMT-aged组与FMT-adult组小鼠海马区几个差异表达的蛋白质。研究表明，差异表达蛋白有140个，高表达蛋白有52个，低表达蛋白有88个，其中差异表达蛋白47个，倍数变化大于1.5(表1)。
表1 IPA通路（Ingenuitypathway analysis）分析
FMT-aged组小鼠中，87种与学习和认知能力相关的蛋白质表达显著变化，表明生理衰老过程中出现的大脑功能衰退(图7)。微生物组和蛋白质组数据的整合并没有明显的关联(图8)。但值得注意的是，作者发现Faecalibaculum, Lachnospiraceae和Ruminococcaceae与线粒体能量新陈代谢有关的蛋白质有很大的相关性(图8)。
图7 IPA分析图
FMT-aged组和FMT-adult组小鼠的海马蛋白进行IPA比较。圆圈代表主要网络节点，蓝色代表显著下调的节点，红色代表上调。
图8 粪便微生物组学和海马蛋白质组学数据的Person相关性热力图
年轻小鼠经过FMT后其海马伞的小胶质细胞表型改变，但肠道通透性以及细胞因子的水平未改变
有研究表明，老年小鼠FMT可导致被移植小鼠全身炎症反应，因此，作者研究了老年小鼠FMT对炎性因子水平和肠道通透性的影响。实验表明，FMT后肠道通透性(图9A)和血浆炎症细胞因子水平(图9B)都没有改变。此外，作者还评估了FMT治疗组海马蛋白提取物中细胞因子的表达水平，没有检测到任何细胞因子之间的差异，说明至少在FMT后的这个时间点没有发现任何证明FMT引发了神经炎症细胞因子。
图9 老年小鼠FMT对肠道通透性和循环细胞因子无明显影响
给小鼠灌胃FITC-葡聚糖溶液，180分钟后测定血浆浓度。FMT-adult组与FMT-aged组之间无明显差异。血浆样本也用于评估循环细胞因子的水平，但两组间的促炎性和抗炎细胞因子的水平无显著变化。
此外，接受老年小鼠FMT后的小鼠海马区星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达没有明显增加(图10A-H)，进一步证实了老年小鼠FMT后的小鼠缺乏明显的神经炎性反应。但在海马伞白质的胶质细胞中作者观察到F4/80的表达显著增加(P=0.0168)，F4/80的表达是衰老大脑的典型标志物(图10J-L)。
图10 FMT后海马区GFAP和F4/80的水平
A,D,GFMT-adult组GFAP荧光染色代表图。B,E,H FMT-aged组GFAP荧光染色代表图。C,F,I为GFAP的荧光强度统计图。J,K和FMT-adult组比，FMT-aged组海马伞白质中F4/80(红色)的表达显著增加。
结论
本文的研究结果进一步证明了肠道微生物群在健康和疾病中最重要的作用，并强调了肠道微生物群在脑-肠轴上最重要的作用。年龄变化影响了肠道微生物群组成，对中枢神经系统的功能有直接影响，导致空间学习和记忆等功能衰退。最近也有研究证明，改变与年龄相关的微生物群有利于健康和延长寿命，本文为通过使肠道菌群年轻化改善老年相关疾病（如改善认知），提高老年人生活质量等的治疗方案设计提供了强有力的支持。