科研 | J Proteome Res：使用蛋白质组学发现金黄色葡萄球菌的蛋白生物标记物（国人佳作）
编译：微科盟大陈子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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快速鉴定对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）、万古霉素中间型金黄色葡萄球菌（hVISA）和万古霉素中间型金黄色葡萄球菌（VISA）对准确治疗、及时干预和预防暴发具有重要意义。本文对90株金黄色葡萄球菌分离株进行了蛋白质生物标记物分析，包括MSSA、万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌（VSSA）、hVISA和VISA菌株。无标记数据独立采集蛋白质组学用于鉴定蛋白质生物标记物，以区分MSSA、hVISA和VISA菌株。我们共鉴定出8786个非冗余肽，对应418个不同的非冗余蛋白，发现并验证了两个具有高灵敏度和特异性的VISA蛋白生物标志物、两个hVISA蛋白生物标志物和一个MSSA蛋白生物标志物。数据可通过标识符为MSV00085776的MassIVE获得。
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实验设计
1. 采用nano-LC-MS/MS和DIA法分别提取和分析四种类型的90株金黄色葡萄球菌的蛋白；
2. 利用热图分析四种类型菌株中蛋白质表达水平的差异；
3. 利用火山图分析和鉴定潜在的生物标志物，以区分任何两种金黄色葡萄球菌菌株群；
4. 利用ROC曲线分析生物标志物区分金黄色葡萄球菌菌株的能力，生物标志物对金黄色葡萄球菌的敏感性和特异性分析。
实验结果
1. 金黄色葡萄球菌蛋白的DIA-MS检测
我们共调查了90株金黄色葡萄球菌，包括MSSA（n=21）、VSSA（n=25）、hVISA（n=29）和VISA（n=15），并采用纳米LC-MS/MS和DIA法分别提取和分析细菌蛋白，其中，QC样品（90个菌株的混合样品）用于监测纳米LC-DIA的系统稳定性。我们从质控样品中提取m/z968.504的峰值信号，观察信号的重现性，发现，在150h连续纳米LC-DIA分析期间，峰值信号的变异系数（CV）约为7%，信号稳定性适合于进行无标记蛋白质组学。我们共鉴定出8786个非冗余肽，对应418个非冗余蛋白。热图显示在MSSA、VSSA、hVISA和VISA菌株中有47种蛋白质的表达水平存在显著差异（图1）。火山图应用于鉴定潜在生物标志物的数据，以区分任何两个金黄色葡萄球菌菌株群（图2）。在峰值中，显著性得分计算为−10 log P.24，显著性>30（P值<0.001）且倍数变化>2或<0.5的蛋白质被标记（支持表1）。与MSSA（图2A）、VSSA（图2B）和hVISA（图2C）菌株相比，VISA菌株分别有11、20和33个上调蛋白和9、3和7个下调蛋白。hVISA菌株与MSSA相比有10个上调蛋白和29个下调蛋白（图2D），与VSSA相比有18个上调蛋白和20个下调蛋白（图2E）；与MSSA相比，VSSA菌株有1个上调蛋白和30个下调蛋白（图2F）。
图1 热图描绘了MSSA（n=21）、VSSA（n=25）、hVISA（n=29）和VISA（n=15）的无标记DIA定量蛋白质组学分析后确定的所有蛋白质的丰度
每列显示一个单独的分离物，每行描述一个独特的蛋白质。右边的图例表示中间比率的颜色键。
图2 比较（A）VISA/MSSA，（B）VISA/VSSA，（C）VISA/hVISA，（D）hVISA/MSSA，（E）hVISA/VSSA和（F）VSSA/MSSA的金黄色葡萄球菌分离物的六对分析火山图
比较显示为蛋白质丰度与倍数变化率的统计显著性。红色（上调）和绿色（下调）点代表显著性高于30的蛋白质，倍数变化大于2。
2. 用于识别VISA、HVISA、VSSA和MSSA的潜在蛋白质生物标记物
为了确定特定于单个组的标记，我们选择了一种与其他菌株组相比显著升高或降低的蛋白质。从DIA定量结果得到的肽峰面积总和用于表达针对VISA、hVISA、VSSA或MSSA的蛋白质标记的相对丰度。我们发现，与其他菌株相比，肽甲硫氨酸亚砜还原酶MsrB（MsrB；图3A）和转录调节因子SarA（SarA；图3B）在VISA中高度表达；延伸因子Tu（EF-Tu；图3C）和丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）的二氢脂酰赖氨酸乙酰转移酶成分（OPD2；图3D）在hVISA中高度表达；HTH型转录调节因子SarR（SarR；图3E）在MSSA菌株中高表达；而VSSA中没有高表达的特异性蛋白标记，每个定量肽的峰面积也显示在支持图1中。支持信息图1中的标准差（SD）和CV值表明临床分离株之间的蛋白质差异，而不是技术复制品的差异。各组内肽丰度的变异系数较大，可能表明同一菌株临床分离株的蛋白表达水平较低。
图3 用nano-LC-MS/MS和DIA测定MSSA（n=21）、VSSA（n=25）、hVISA（n=29）和VISA（n=15）菌株的蛋白质标记丰度
（A） MSRB、（B）SARA、（C）EF Tu、（D）ODP2和（E）SARR。相对强度用方框图表示，用四分位值（25%，75%）的中位数表示。
3. 生物标志物对金黄色葡萄球菌的敏感性和特异性分析
受试者操作特征（ROC）分析用于研究蛋白质生物标志物区分金黄色葡萄球菌菌株的能力（图4）。与hVISA、VSSA和MSSA相比，VISA菌株MSRB和SARA的AUC值分别为0.93（图4A），其联合AUC值增加至0.95，敏感性为93.3%，特异性为88%（图4A）。对于hVISA的鉴定，EF-Tu和ODP2的AUC值分别为0.90和0.76，其联合AUC值为0.90，敏感性和特异性分别为86.21%和86.89%（图4B），所鉴定的蛋白质是区分VISA、hVISA和MSSA的理想候选生物标志物，SARR用于区分MSSA与VISA、hVISA和VSSA（AUC=0.75），敏感性和特异性分别为66.67%和84.06%（图4C）。五种蛋白质标记物对单个菌株的敏感性、特异性和AUC值也显示在支持表2中。
图4 对金黄色葡萄球菌菌株具有最高鉴别能力的蛋白质生物标记物的受试者操作特征（ROC）分析
（A）分析MSRB和SARA蛋白的ROC曲线，以确定VISA与hVISA、VSSA和MSSA的鉴别能力。（B）对EF-Tu和ODP2蛋白的ROC曲线进行分析，探讨其对hVISA的识别能力。（C）分析SARR蛋白ROC曲线对MSSA与VISA、hVISA和VSSA的识别能力。
讨论
金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性降低，这对医学界构成重大问题。VISA对万古霉素的耐药性是通过减少自溶和细胞壁周转以及增强细胞壁合成的活化来诱导的，这导致细胞壁增厚，减少药物进入其活性部位。本研究证明MSRB和SARA蛋白是具有高AUC值的潜在VISA特异性生物标记物（图4A）。MSRB是一种抗氧化剂，属于蛋氨酸亚砜还原酶（MSR）家族，这种酶减少蛋白质结合的蛋氨酸亚砜，并介导其他蛋氨酸残基的氧化还原，恢复正常的蛋白质功能。万古霉素是一种糖肽类抗生素，能诱导羟自由基的形成，从而抑制金黄色葡萄球菌的细胞壁合成。MSRB在VSSA向VISA转化过程中高表达，这可能是万古霉素引起氧化损伤的应激反应机制。
SARA是一种转录因子，参与抗生素抗性、毒力控制、细胞壁合成和其他防御途径。SARA的突变形式改变了capJ、purA、fnbA、fnbB、alt、lrgB、purM、nuc和spa的调节，因此，这种蛋白质对于促进VISA的万古霉素耐药性至关重要。由于VISA和hVISA分离株具有相似的表型，用常规的临床方法进行鉴定既费时费力又不一致；然而，本研究建议将MSRB和SARA结合起来作为诊断生物标志物，因为MSRB和SARA对区分VISA分离株和其他金黄色葡萄球菌菌株具有较高的敏感性（0.933）和特异性（0.88）。
我们的结果表明，在hVISA与其他耐药金黄色葡萄球菌菌株的分化中，EF-Tu和ODP2是AUC值最高的蛋白质（图4B）。在原核生物中，EF-Tu参与蛋白质生物合成过程中多肽链的延伸。超过30种抗生素结合EF-Tu，降低EF-Tu功能，抑制蛋白质合成，因此，EF-Tu的高表达增加了抗生素耐药性。最近，金黄色葡萄球菌中的EF-Tu被鉴定为一种膜结合蛋白，并与P物质相互作用，P物质是一种参与调节皮肤菌群稳态的神经肽。
丙酮酸是增强金黄色葡萄球菌致病性的代谢物。ODP2是丙酮酸脱氢酶复合物（PDHC）的一种酶组分，它将丙酮酸转化为乙酰辅酶A和CO2进入三羧酸（TCA）循环。促进TCA循环是恢复细菌对抗生素的敏感性所必需的。hVISA中ODP2的高表达可能与其对万古霉素的敏感性（MIC为2-4 mg/L）高于VISA菌株（MIC为4-8 mg/L）有关。
Sar家族是金黄色葡萄球菌的转录调节因子，与金黄色葡萄球菌的感染、毒力、自溶和耐药性有关。HTH型转录调控因子SarR（SarR）蛋白是SARA转录的负调控因子。在本研究中，我们发现SARA和SARR蛋白分别在VISA（图3B）和MSSA（图3E）中高表达。这进一步说明了SARR和SARA蛋白在金黄色葡萄球菌耐药性进化中的重要性，这些蛋白质是开发用于鉴定VISA和MSSA菌株的诊断生物标志物的理想候选。
结论
我们使用直接DIA分析VISA、hVISA和MSSA分离株的单个蛋白质组以探寻新的蛋白质生物标记物，结果发现有五种蛋白质生物标志物具有高度的敏感性和特异性，这些蛋白质能够成功区分不同的VISA、hVISA和MSSA菌株，其中，MSRB和SARA被发现是VISA的蛋白质标记物，联合AUC为0.95；EF-Tu和OPD2是hVISA的蛋白标记物，联合AUC为0.90，据我们所知，这是第一个显示VISA和hVISA蛋白质标记物AUC大于0.90的研究。