编译：Mr.Left，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
弱的茎机械强度严重限制了切花的质量，并且通过Ca处理可以缓解弱的机械强度，但是，Ca介导的增强茎机械强度的潜在机制仍然未知。在本研究中，作者对用纳米CaCO3处理过的芍药（Paeonia lactiflora Pall。）花序柄进行了转录组学，蛋白质组学和代谢组学分析。在对照和纳米CaCO3处理之间共检测到2643个差异表达基因（DEG）和892个差异表达蛋白质（DEP）。在892个DEP中，有152个在蛋白质组学和转录组学水平上被共调节，而与次生细胞壁相关的24个DEP参与信号转导，能量代谢，碳水化合物代谢和木质素生物合成，在花序茎的发育过程中，大多数经过纳米CaCO3处理后上调。在这四个途径中，鉴定了与木质素生物合成有关的许多差异表达代谢物（DEM）。此外，结构观察显示，厚壁组织细胞壁增厚，并且主要细胞壁组分木质素响应纳米CaCO3处理而显著积累，从而表明Ca可通过增加木质素积累来增强花序柄的机械强度。
原名：Integration of Transcriptome, Proteome, and Metabolome Provides Insights into How Calcium Enhances the Mechanical Strength of Herbaceous Peony Inflorescence Stems
译名：转录组，蛋白质组和代谢组整合分析钙如何增强草本牡丹花序柄机械强度
期刊：Cells
IF：4.366
发表时间：2019.01
通讯作者：陶俊
通讯作者单位：扬州大学
DOI号：10.3390/cells8020102
1 形态指标和光合特性
纳米CaCO3处理显著影响芍药的生长和发育。就形态而言，芍药的顶部花序柄在花发育过程中弯曲，而在用纳米CaCO3处理后其变为直立的（图1A）。此外，花序柄的机械强度显示出逐渐增加的趋势。纳米CaCO3处理的机械强度值显著高于对照的机械强度值，特别是在S3和S4处，强度提高了30％以上。在对照和纳米CaCO3处理组中，在其他形态指标中也检测到了相同的增长趋势，包括植株高度，花重和直径以及花序茎的重量和直径。与对照相比，除植株高度外，纳米CaCO3处理的所有指标均增加（图1B）。此外，Pn和Tr都逐渐增加直到S3，然后在对照和纳米CaCO3处理组均下降。纳米CaCO3处理后的Pn高于对照，从S3到S4的Pn显著增加量大于9.88％。相反，尽管纳米CaCO3处理后的Tr值略高于对照，但差异并不明显（图1C）。结果，纳米CaCO3处理显著增强了花序柄的机械强度并增强了芍药的光合作用。
图1 纳米CaCO3处理对芍药四个发育阶段的形态指标和光合特性的影响。（A）花序柄的照片；棒=5厘米。（B）形态指标。（C）光合特性。Pn，光合作用速率；Tr，蒸腾速率。值表示为平均值±SD，不同字母表示显著差异（p <0.05）。S1，花蕾期；S2，着色期；S3，花苞期；S4，盛花期。为了阐明Ca介导的芍药花序柄机械强度增强的潜在机制，最初进行了RNA-seq。在对照和纳米CaCO3处理组的S4收集花序柄的前12 cm，以进行RNA提取。构建鸟枪文库并测序。总共获得了40.31 Gb序列数据（NCBI登录号：SRP127132）。经过质量检查，接头修整和尺寸选择后，对照和纳米CaCO3处理的高质量片段比率分别为83.48％，89.89％和84.40％，90.72％，87.85％和86.37％（表S2）。然后使用Trinity进行从头组装，并获得107929个独立基因的最终高质量数据集，平均长度为781 bp，N50为1488 bp（表S3）。随后，使用七个公共数据库对这些独立基因进行了注释。总共注释了61483个独立基因，占所有独立基因的56.97％。其中，可以将55138、46445、37335、41032、22478、43952和26895个单基因分别注释到NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO数据库，分别占独立基因的51.09%、43.03%、34.83%、38.02%，40.72%和24.92％。经过比较分析，总共获得了2643个DEG，包括1466个上调的DEG和1177个下调的DEG（图2A）。在这些DEG中，有11个转录因子家族，转录因子富集分析显示，AP2-EREBP，NAC，Tify，WRKY和MYB占优势（图2B）。为了验证这些DEG，通过qRT-PCR分析了20个随机选择的DEG的表达水平。作者发现，从RNA-Seq和qRT-PCR分析获得的纳米CaCO3/对照结果的log2相对表达水平是一致的，并且它们之间存在显著的正相关（R2 = 0.9182），从而表明RNA-seq结果可信（图2C）。为了阐明这些DEG的功能，将它们分配给GO类别，并分为以下三个主要类别：生物过程，细胞组分和分子功能（图2D）。经过RNA-seq纳米CaCO3处理组后，总共获得了2643个DEG，通过qRT-PCR分析得到的结果是可信的。
图2 纳米CaCO3处理对芍药花序柄转录组的影响。（A）差异表达基因（DEG）的火山图。X轴代表经log2转换后的倍数变化，Y轴代表经log10转换后的调整后的p值，红点代表上调的DEG，蓝点代表下调的DEG，黑点代表非DEG。（B）DEG的转录因子家族分类。X轴代表DEG的数目，Y轴代表转录因子家族。（C）从RNA-seq和qRT-PCR分析获得的纳米CaCO3/对照中20个DEG的表达结果的log2相对表达水平的热图；CAM，钙调蛋白基因；CML，类钙调蛋白基因；CIPK，类钙调磷酸酶B蛋白相互作用蛋白激酶基因；CDPK，钙依赖性蛋白激酶基因；XYL4，木聚糖1,4-β-木糖苷酶基因；ENG，内切葡聚糖酶基因；GPMI，2,3-双磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶基因；PGD，6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因；PAL，苯丙氨酸解氨酶基因；CCR，肉桂酰辅酶A还原酶基因；CAD，肉桂醇脱氢酶基因；CSE，咖啡酰莽草酸酯酶基因；COMT，咖啡酸3-O-甲基转移酶基因；CCoAOMT，咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶基因；ABC，ABC转运蛋白；ALDH，乙醇脱氢酶；DLST，二氢脂酰胺琥珀酰转移酶。（D）对DEG进行GO分类。X轴表示DEG的数量，Y轴表示GO项。使用iTRAQ方法对通过RNA-seq测定的相同样品进行蛋白质组分析。获得与19326个已知肽匹配的的256853个光谱，并鉴定出5045个蛋白质。在纳米CaCO3处理下，与对照相比，发现了892个DEP。其中，上调了492个，下调了400个（图S1A）。为了进一步探索这些DEP的功能，进行了KEGG富集分析。将892个DEP注释为102条KEGG途径，并且显著富集了8个途径，包括核糖体，苯丙烷类生物合成，氰基氨基酸代谢等（图S1B）。进行了基因和蛋白质表达变化的一致性分析。在这项研究中，蛋白质组分析中鉴定出的蛋白质中超过99％也被转录组分析所覆盖，而仅通过iTRAQ鉴定出的蛋白质中只有不到1％（图3A）。在nano-CaCO3 /对照中，蛋白质的倍数表达水平与其各自的mRNA值相关。从差异表达的类型来看，2643个DEG和892个DEP之间的相关数量为152（图3B）。比较转录本和蛋白质水平的表达变化时，观察到定量蛋白质水平与其基因转录水平之间的相关性较差，而DEG和DEP之间的相关性相对较高（图3C）。随后，对DEG和DEP进行KEGG富集分析，DEG和DEP的前20条KEGG途径如图3D所示，详细数据在表S4中给出。结果显示，发现DEG在总共14个途径中被显著富集，而DEP在8个途径中被显著富集。相比之下，在转录本和蛋白质水平上，只有苯丙烷类生物合成和核糖体被显著富集。苯丙烷类生物合成是木质素生物合成的重要途径。在该途径中，已检测到9个基因及相关蛋白，即苯丙氨酸解氨酶基因（PAL），肉桂酸4-羟基化酶基因（C4H），4-香豆酸CoA连接酶基因（4CL），肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR），肉桂醇脱氢酶基因（CAD），咖啡酰莽草酸酯酶基因（CSE），咖啡酸3-O-甲基转移酶基因（COMT），咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶基因（CCoAOMT）和过氧化物酶基因（POD）。这些基因的表达模式如图4A所示，其中C4H，4CL，CSE，COMT和CCoAOMT在转录本水平上被显著上调，尽管在蛋白质水平上未检测到显著差异。PAL，CCR，CAD和POD在转录本和蛋白质水平上均显著差异表达。其中，CCR，CAD和POD在转录本和蛋白质水平上均被上调，而PAL显示相反的表达模式。此外，Ca2+感受器（包括钙调蛋白基因（CAM），类CAM蛋白基因（CML），类钙调磷酸酶B蛋白相互作用蛋白激酶基因（CIPK）和钙依赖性蛋白激酶基因（CDPK））也在转录本水平上存在差异表达。响应于纳米CaCO3处理，CAM在蛋白质水平上也被显著激活。除了参与苯丙烷类生物合成和钙信号转导的相关基因和蛋白质外，还从以前研究的152种相关DEP和DEG中筛选了11种相关DEG和DEP，包括氧化磷酸化中的H+转运ATP酶基因（PMA），V型H+转运ATP酶16 kDa蛋白脂质亚基基因（ATP6V0C）和V型H+转运ATP酶亚基E基因（ATP6V1E）的；糖酵解中2,3-双磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶基因（GPMI），4-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）和果糖双磷酸醛缩酶基因（ALDO）；戊糖磷酸途径中的6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因（PGD）和磷酸核酮糖3-差向异构酶基因（RPE）；淀粉和蔗糖代谢中的木聚糖1,4-β-木糖苷酶基因（XYL4）和内切葡聚糖酶基因（ENG）；以及ABC转运蛋白中的ABC亚家族F成员1（ABCF1）（表S5）。这些基因的表达模式可分为以下几类。ATP6V0C，ATP6V1E，GPMI，ALDO，PGD，RPE和ABCF1在转录本和蛋白质水平上均增加；XYL4和ENG在转录和蛋白质水平均降低；PMA在转录水平上增加，但在蛋白水平降低；而GAPDH在蛋白质水平增加，但在转录水平降低（图4A）。在对照和纳米CaCO3处理中，大多数选定基因的表达模式均显示出从S1到S4的上升趋势。这种趋势的例外是对照组中NAC，CDPK和PGD的表达，其表现为先降低后升高。在中对照中CML，ATP6V0C，PAL和POD和纳米CaCO3处理中PGD的表达最初保持稳定，然后呈上升趋势；在对照和纳米CaCO3处理中，ENG和ABCF1的表达最初从S1升高到S3，然后在S4降低（图4B）。与对照组相比，在花序柄发育期间，这些基因在纳米CaCO3处理中的表达水平更高，特别是S2的GAPDH；S3的NAC，CAM，GPMI，4CL，CCoAOMT，POD和ABCF1；S4的NAC，CML，4CL和POD。然而，在S1，这些基因的一半的表达低于对照。此外，XYL4在S3和S4处表达较低，而ENG在S4处表达较低（图4B）。大体上，在纳米CaCO3处理后获得892个DEP，其中152个DEP在蛋白质组和转录组水平上被共调节，它们均富含苯丙烷类生物合成和核糖体。筛选了与次生细胞壁有关的24个DEP，这些DEP参与了信号转导，能量代谢，碳水化合物代谢和木质素生物合成，其中大多数在花序柄发育过程中经过纳米CaCO3处理后被上调。
图3 纳米CaCO3处理对芍药花序柄蛋白质组的影响。（A）转录组和蛋白质组之间的相关数量的维恩图。红色代表基因数量，绿色代表蛋白质数量。（B）基于定量蛋白质和相关基因的转录组和蛋白质组学谱的表达率。X轴代表蛋白质经log2转化的倍数变化，Y轴代表相关基因经log2转化的倍数变化。不同的颜色表示显著的表达变化：蓝点，仅蛋白质，绿点，仅转录本；红点，两者。（C）在五个类别中转录组和蛋白质组之间的相关数量的Pearson系数分布。X轴表示类别，Y轴表示Pearson相关系数。（D）DEG和差异表达蛋白（DEP）的途径富集分析。X轴代表DEG和DEP的数目，Y轴代表途径名称，红色代表基因，绿色代表蛋白质，*代表DEG和DEP显著富集的途径。
图4 基因表达的热图。（A）参与信号传导，能量代谢，碳水化合物代谢和木质素生物合成的相关DEG和DEP表达的热图，绿色表示减少，红色表示增加。（B）在四个发育阶段中22种蛋白质编码基因表达的热图。在对照，纳米CaCO3处理中，22个蛋白质编码基因的log2相对表达水平，红色表示较高的表达水平，蓝色表示较低的表达水平。纳米CaCO3/对照中22种蛋白质编码基因的相对表达水平的比值，红色表示增加，蓝色表示减少。CAM，钙调蛋白基因；CML，类钙调蛋白基因；CIPK，类钙调磷酸酶B蛋白相互作用蛋白激酶基因；CDPK，钙依赖性蛋白激酶基因；ATP6V0C，V型H+转运ATP酶16 kDa蛋白脂质亚基基因；GPMI，2,3-双磷酸甘油酸非依赖性磷酸甘油酸变位酶基因；GAPDH，4-磷酸甘油醛脱氢酶基因；PGD，6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因；XYL4，木聚糖1,4-β-木糖苷酶基因；ENG，内切葡聚糖酶基因；PAL，苯丙氨酸解氨酶基因；C4H，肉桂酸4-羟基化酶基因；C4L，4-香豆酸辅酶A连接酶基因；CCR，肉桂酰辅酶A还原酶基因；CAD，肉桂醇脱氢酶基因；CSE，咖啡酰莽草酸酯酶基因；COMT，咖啡酸3-O-甲基转移酶基因；CCoAOMT，咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶基因；POD，过氧化物酶基因；ABCF1，ABC亚科F成员1。S1，花蕾期；S2，着色期；S3，花苞期；S4，盛花期。使用LC-MS/MS的代谢组分析进一步验证了纳米CaCO3处理对前面章节中转录组和蛋白质组学变化的影响。纳米CaCO3处理对细胞代谢物有相当大的影响，表S6中列出了用详细数据筛选的26种差异代谢物。在苯丙烷类生物合成途径中检测到16种差异代谢物，而其余的分布在各种代谢途径中，包括植物激素中的吲哚-3-乙酸，赤霉素A1，茉莉酸和水杨酸；糖代谢中涉及的蔗糖，麦芽糖和异麦芽糖；与半纤维素合成有关的β-d-葡萄糖和α-d-半乳糖；与纤维素代谢有关的纤维二糖；以及苯丙氨酸生物合成有关的3-脱氢莽草酸和预苯酸。如图5所示，除了咖啡酰莽草酸，甲基胡椒酚和甲基丁子香酚外，这些代谢物的积累显著增加。纳米CaCO3处理诱导的mRNA，蛋白质和代谢产物的整合如图6所示。结果表明，C4H，4CL，CSE，COMT和CCoAOMT的表达增加，而蛋白表达水平没有变化。另外，一些基因被诱导，例如PAL，而相应的蛋白质被抑制。相反，在一些实例，包括CCR，CAD和POD，基因和相应的蛋白质均被诱导。在这些基因中，CCR，CAD和POD催化H-木质素，G-木质素和S-木质素的合成。此外，H-木质素，G-木质素和S-木质素的前体，例如对香豆醇，咖啡乙醇，松柏醇和芥子醇的积累都增加了。甲基炭和甲基丁子香酚的积累，尽管与H-木质素和G-木质素具有相同的前体，但在纳米CaCO3处理后有所减少。综上所述，基于转录组和蛋白质组学分析筛选了26种差异代谢产物，其中16种在苯丙烷生物合成途径中被检测到，且大部分被上调。
图5 纳米CaCO3处理对芍药花序柄代谢物的影响。纳米CaCO3/对照中参与碳水化合物代谢，苯丙氨酸生物合成和苯丙烷类生物合成的主要代谢物log2相对水平的热图。深红色和浅红色分别表示代谢物增加和减少。
图6 纳米CaCO3处理诱导的芍药花序柄的mRNA，蛋白质和代谢物在苯丙烷类生物合成途径中的整合。PM，质膜；SCW，次生细胞壁；PCW，初生细胞壁；ML，胞间层。PAL，苯丙氨酸解氨酶基因；C4H，肉桂酸4-羟基化酶基因；C4L，4-香豆酸辅酶A连接酶基因；CCR，肉桂酰辅酶A还原酶基因；CAD，肉桂醇脱氢酶基因；HCT，莽草酸/奎宁酸香豆酰转移酶；C3H，对香豆酸3-羟化酶；C3'H，对香豆酸3'-羟化酶；CSE，咖啡酰莽草酸酯酶基因；COMT，咖啡酸3-O-甲基转移酶基因；F5H，阿魏酸5-羟化酶；CCoAOMT，咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶基因；POD，过氧化物酶基因。作者还观察了对照组和纳米CaCO3处理组的花序柄的显微组织。扫描电子显微镜照片表明，在S1处形成了多个部分，即表皮，皮层和中柱；对照和纳米CaCO3处理之间没有显著差异。但是，随着花序柄的继续生长，发生了一定的变化。例如，细胞变得更紧密地排列，并且厚壁组织增厚，并且这些变化在S4时尤其明显。当与对照组相比时，在纳米CaCO3处理下，厚壁组织的厚度和增厚的细胞层数显著增加（图7A）。为了更好地观察厚壁组织的厚度，进行了透射电镜观察，观察结果与使用扫描电子显微镜观察的结果一致，即纳米CaCO3处理下的厚壁组织明显比对照细胞膜厚（图7B）。用千分尺测量，纳米CaCO3处理下的厚壁组织厚度与对照组相比从S2到S4显著增加（257.87％），从S2到S3和S3到S4分别增加了20.19％和25.22％。结果表明，纳米CaCO3处理显著增加了厚壁组织的厚度和增厚的细胞层数。
图7 纳米CaCO3处理对芍药四个发育阶段的花序柄显微组织的影响。（A）扫描电镜。在对照和纳米CaCO3处理组中的花序柄切片。区域局部放大的显微照片由箭头标记。Ep，表皮；Co，皮质；Pi，木髓；Xy，木质部。棒，100 µm。（B）透射电镜。在对照和纳米CaCO3处理中的花序柄切片。CW，细胞壁。棒，5 µm。S1，花蕾期；S2，着色期；S3，花苞期；S4，盛花期。为了验证增厚的细胞壁中的木质素是否在芍药花序柄的机械强度中起决定性作用，确定了细胞壁的组成。首先，使用XPS确定了细胞壁的元素组成。表1列出了由宽角扫描光谱中的C1s，O1s，N1s和Ca2p峰整合产生的细胞壁材料的元素组成。除S1外，纳米CaCO3处理促进了花序柄细胞壁中N和Ca浓度的增加，并且浓度差异在S3达到了显著水平。相反，对照和纳米CaCO3处理之间在C和O方面未检测到显著差异。对应于C的XPS峰在高分辨率下进行了分析和退卷积以评估每个组分的贡献。图8A显示了对照和纳米CaCO3处理的植物的细胞壁的C1s发射谱线的退卷积XPS光谱。不论处理如何，碳峰（C1s）匹配了五个组分：在～284.80 eV（C1）处，仅与碳或氢结合的碳C–（C，H）；在～286.55 eV（C2）处，碳单键结合到氧或氮C-（O，N）；在～288.03 eV（C3）处，碳与氧成双键（C = O）或单键与两个氧原子（O-C-O）结合；在～289.26 eV（C4）处，组成羧基的碳，COOR；在～289.88 eV（C5）处，组成碳酸盐功能的碳。无论是对照还是纳米CaCO3处理，在XPS光谱上，C2对C1s发射谱线的贡献最大，其次是C1，C3，C4和C5，（表2）。纳米CaCO3处理后，C1和C2的相对浓度略有增加，而C3和C4的相对浓度略有下降。除了在S4处的C5外，纳米CaCO3处理不会引起C1s发射谱线这五个成分的相对浓度的显著变化。随后，在化学提取花序干细胞壁后，通过FTIR显微术鉴定了每个部分的成分和可能的交联（图8B）：化学键的振动吸收了4000 cm-1至400 cm-1的IR区域中的放射线，并且每个分子中的官能团在红外光谱中具有其特征吸收频率。按如下所述将官能团分配给光谱峰：1740 cm-1（羰基C = O），1640 cm-1（酰胺C = O），1510 cm-1（芳香族骨架振动），1465 cm-1、1425 cm-1、1325 cm-1（木质素），1375 cm-1（CH带），1245 cm-1（蛋白质中的酰胺III）和1160 cm-1、1107 cm-1、1060 cm-1和899 cm-1（CHO）。对照和纳米CaCO3处理获得的光谱大致相似，尽管特征区域存在一些定量差异，表明细胞壁成分有所不同。例如，在1640、1510、1465、1425和1325 cm-1处的振动是木质素或类木质素结构的特征，在通过纳米CaCO3处理获得的光谱中更高。总体而言，纳米CaCO3处理促进了Ca浓度和对花序柄细胞壁中响应木质素或类木质素结构的化学基团含量的增加。
图8 纳米CaCO3处理对芍药花序柄细胞壁组分的影响。（A）细胞壁的退卷积高分辨率XPS C1s光谱。（B）在4000–400 cm-1区域中细胞壁的吸收FTIR光谱。S1，花蕾期；S2，着色期；S3，花苞期；S4，盛花期。表1 使用X射线光电子能谱（XPS）测定的芍药花序柄中细胞壁的元素组成。原子比（％）从低分辨率全元素扫描获得。值表示平均值±SD。不同的字母表示显著差异（p <0.05）。S1，花蕾期；S2，着色期；S3，花苞期；S4，盛花期。从高分辨率光谱获得官能团组成的定量。值表示平均值±SD。不同的字母表示显著差异（p <0.05）。S1，花蕾期；S2，着色期；S3，花苞期；S4，盛花期。组织化学染色用于进一步检测增厚的细胞壁内木质素的变化。已知使用间苯三酚-HCl进行Wiesner染色会与木质素中的肉桂醛残基反应，并且颜色强度与总木质素含量一致。在对照组和纳米CaCO3处理组之间，在花序柄发育期间存在明显的颜色差异，特别是在厚壁组织细胞和维管束区域（图9）。在S1处，横切面几乎未染色，而从S2到S4逐渐出现红色。纳米CaCO3处理的茎的厚壁组织细胞和维管束区域被染成深红色，而对照中则呈浅红色，尤其是在S4处。简而言之，纳米CaCO3处理显著增加了木质素在花序柄的厚壁组织细胞和维管束区域的沉积。
图9 在四个发育阶段经过对照和纳米CaCO3处理的芍药花序柄中木质素的组织化学染色。用间苯三酚-HCl染色8微米厚的横切面，选择性地染色木质化的细胞壁。在对照和纳米CaCO3处理中的花序柄切片。黑框标出区域局部放大的显微照片。Ep，表皮；Co，皮质；Vb，维管束；Pi，木髓；Xy，木质部。棒，150 µm。S1，花蕾期；S2，着色期；S3，花苞期；S4，盛花期。作为植物必需的营养素之一，Ca2+长期以来被认为是信号转导的第二信使。它在调节植物细胞功能（如细胞伸长和分裂），细胞膜完整性，氮，碳水化合物和活性氧代谢方面起着重要的生理作用，这些影响植物的光合作用，果实品质，抗逆性和茎机械强度。在机械强度方面，外源Ca处理已显示延缓了非洲菊的茎弯曲，并观察到收获前喷洒4％乙酸钙或氯化钙可显著提高芍药花序柄的机械强度。在本研究中，发现用2％的纳米CaCO3处理对芍药花序柄的机械强度具有相似的影响，并观察到增加了30.73％。在植物中，茎机械强度与某些形态指标有关，包括植物高度，茎直径和茎重等。在芍药中，花序柄的直径是可用于估计机械强度的直接指标，并且在收获前喷洒4％乙酸钙或氯化钙也发现了花序柄直径的显著增加。在本研究中，用2％纳米CaCO3处理导致芍药花序柄直径增加了9.26％，而芍药的株高显著降低了17.72％，这与用4％醋酸钙处理过的芍药“Yinxianxiuhongpao”的结果一致。此外，纳米CaCO3处理后，花序茎重，花重和花直径也分别增加了38.77％，20.60％和13.75％。这些结果表明，纳米CaCO3处理不仅可以提高花序柄的机械强度，而且可以提高芍药的花朵质量。此外，纳米CaCO3处理还增强了芍药的光合作用，这与以前的研究结果一致。花朵质量的提高可能是由于光合作用的增强导致光合产物的增加，从而促进了植物的生殖生长。因此，纳米CaCO3可以广泛应用于芍药切花中，以提高花序柄的机械强度，增强切花质量和光合作用。植物茎的机械强度主要取决于其次生细胞壁的强度。以前曾有报道称，在芍药花序柄形成的整个过程中，内部维管束开始出现，细胞排列更紧密，厚壁组织细胞壁增厚；在本研究中也观察到了这些。纳米CaCO3处理后，观察到增厚的细胞层数量显著增加，尤其是在S3和S4处，其数量分别是对照组的1.75和1.56倍。而且，纳米CaCO3处理后，厚壁组织细胞壁的厚度也增加了20％至25％。这些结果与以前的发现非常吻合，后者表明Ca处理增加了细胞壁厚度和细胞面积。此外，以前已经观察到，与柔性茎1（FC1），脆茎5（BC5）和BC12 O. sativa突变体相比，野生型植株的厚壁组织细胞壁厚度增加。因此，芍药花序柄的机械强度主要与厚壁组织细胞壁的变化有关，纳米CaCO3处理后花序柄直径和机械强度的增强可能是由于厚壁组织细胞壁厚度的增加和增厚的细胞层数所致。次级细胞壁主要由木质素，多糖纤维素和半纤维素组成，复杂的次级细胞壁结构的组装取决于几种不同的生物合成和运输途径的协同相互作用。木质素是次生细胞壁的主要成分，并为细胞壁提供抗压强度。从化学上讲，木质素是一种异质且复杂的聚合物，主要衍生自三种类型的羟基肉桂醇单体，即木素对香豆醇，松柏醇和芥子醇，通常称为H-木质素，G-木质素和S-木质素。这些木素通过苯丙烷类生物合成途径在细胞质中产生，并通过特定的转运蛋白（如ABCF1）转运至次生细胞壁，并通过III类POD聚合为木质素。在水稻FC1突变体，菊花，苏丹草和鸭乸草中对茎的特征进行的大量研究表明，木质素含量的降低导致机械强度的降低。在本研究中，确定了木质素生物合成途径，该途径富含10个DEG（PAL，C4H，4CL，CCR，CAD，CSE，COMT，CCoAOMT，POD和ABCF1），以及五个由PAL，CCR，CAD，POD和ABCF1编码的DEP。这些都在木质素生物合成和植物发育中起重要作用。作者还发现，在纳米CaCO3处理后，尤其是在S4处，这10个DEG的表达水平均显著上调。在蛋白质水平上，纳米CaCO3处理显著上调了CCR，CAD，POD和ABCF1；而PAL在S4时被下调，从而导致木质素在芍药花序柄中积累。代谢组学分析进一步证实了这些结果，结果表明，响应于纳米CaCO3处理，参与木素生物合成的代谢物的积累增加了，包括起始产物苯丙氨酸，中间产物咖啡酰辅酶A，前体松柏醇和芥子醇。此外，从XPS和FTIR分析获得的光谱还显示，用纳米CaCO3处理的花序柄细胞壁中木质素的相对含量增加。一致地，用间苯三酚-HCl进行组织化学染色还显示，纳米CaCO3处理后，厚壁组织细胞壁中木质素含量显著改变。总的来说，这些结果表明木质素在芍药花序柄的机械强度中起着重要作用，这与以前的研究相一致，并且纳米CaCO3介导的花序并机械强度的增强可以归因于木质素积累增加。在植物中，无数的Ca结合蛋白可作为Ca2+感受器来解码复杂特定信号的Ca信号，这些蛋白可分为以下三类：CaM/CML，CDPK和CBL-CIPK。Ca2+感受器在检测到细胞内Ca2+浓度变化后，通过调节下游事件来诱导对信号的生理响应。在本研究中，纳米CaCO3处理后，在芍药花序柄中检测到较高的Ca浓度，并通过RNA-seq鉴定了四个参与钙信号转导的DEG（CAM，CML，CIPK和CDPK），响应于纳米CaCO3处理，所有这些都在S4上调。此外，在S4，CAM在蛋白质水平上也被上调。这些结果与以前研究的结果一致，在以前研究中，证明了Ca增加了Ca2+感受器的表达水平，从而表明纳米CaCO3处理确实诱导了钙信号转导。在能量代谢方面，除蛋白质水平的PMA外，PMA，ATP6V0C和ATP6V1E在转录和蛋白质水平上均差异表达并上调。在非洲菊中，经氯化钙处理的易弯曲茎中的CAM含量以及H+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性增加，并增强了参与茎杆弯曲控制的Ca2+-CAM信使系统。基于这些观察结果，作者推测纳米CaCO3介导的芍药花序柄机械强度的增强可能归因于与Ca2+信使系统相关的机制，尤其是Ca2+-CAM信使系统。此外，在本研究中，共鉴定出11个转录因子家族中的58个DEG，它们被富集在AP2-EREBP，NAC，WRKY，Tify和MYB家族。其中，NAC和MYB家族的家族成员构成了调控次生细胞壁生物合成的绝大多数因子。例如，转录因子MYB20，MYB69，MYB79，MYB85，MYB58和MYB63在木质素生物合成基因的控制中起作用。此外，这两个家族的成员起着CAM结合转录因子的作用。在本研究中，NAC和MYB转录因子均响应纳米CaCO3处理而差异表达，并且在纳米CaCO3处理下它们的表达水平较高，这表明钙结合蛋白可能上调NAC和MYB转录因子，从而诱导次生细胞壁的生物合成。基于上述观察，作者提出了一条途径，其中Ca增强了芍药花序柄的机械强度（图10）。纳米CaCO3处理增加了Ca2+的浓度，而叶片中Ca2+的增加增强了植物的光合作用，导致蔗糖积累，为细胞壁增厚奠定了物质基础。花序干细胞壁中Ca2+浓度增加会诱导钙信号转导（CAM/CML，CIPK和CDPK），然后依次激活属于NAC和MYB家族的下游钙结合转录因子。由于NAC和MYB成员是组成参与调节次生细胞壁生物合成的绝大多数因子，因此这些因子的激活可能会通过增强木素的生物合成来促进次级细胞壁的增厚。对于木素生物合成，木素生物合成基因（PAL，C4H，4CL，CCR，CAD，CSE，COMT和CCoAOMT）的表达显著上调，并且在次生细胞壁成分中木素前体和木质素的积累增加。此外，蔗糖诱导木素底物苯丙氨酸的积累，这也增强了木素的生物合成。总的来说，这些过程导致木质素积累的增加，并且木质素积累与次生细胞壁厚度的增加相关，这导致花序柄直径和机械强度的增加。这些结果将有助于更全面地了解钙施用对芍药切花的影响。
图10提出的钙介导的芍药花序柄机械强度增强的途径。CDPK，钙依赖性蛋白激酶基因；CIPK，类钙调磷酸酶B蛋白相互作用蛋白激酶基因；CAM，钙调蛋白基因；CML，类CAM蛋白基因。
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