编译：Mr.Left，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
超富集植物中的植物促生菌（PGPB）有助于镉（Cd）的吸收，但是其潜在机制尚未得到全面研究。由于这个原因，作者将荧光成像以及转录组和代谢组学方法应用到了已接种或未接种PGPB荧光假单胞菌的Cd超富集植物东南景天中。结果表明，新生长的侧根被荧光假单胞菌大量定殖，是东南景天Cd流入的主要入口。荧光假单胞菌的接种促进了其寄主植物的侧根形成，导致Cd的植物修复效率更高。此外，植物转录组显示细菌接种显著上调了146种植物激素相关基因，其中119个显示出复杂的相互作用，这表明激素串扰参与了根的发育。靶向代谢组学分析表明，荧光假单胞菌接种显著增加了东南景天根中的吲哚乙酸浓度，并显著降低了脱落酸，油菜素内酯，反玉米素，乙烯和茉莉酸的浓度，从而诱导了侧根的生长。总之，该研究的结果强调了PGPB诱导的侧根形成对于超富集植物中Cd吸收增加的重要性。
原名：The plant-growth promoting bacteria promote cadmium uptake by inducing a hormonal crosstalk and lateral root formation in a hyperaccumulator plant Sedum alfredii
译名：植物促生菌通过诱导超富集植物东南景天的激素串扰和侧根形成来促进镉吸收
期刊：Journal of Hazardous Materials
IF：9.038
发表时间：2020.04
通讯作者：冯英
通讯作者单位：浙江大学
DOI号：10.1016/j.jhazmat.2020.122661
1 东南景天根中荧光假单胞菌的定殖
荧光假单胞菌在新出现的侧根上大量繁殖（图1A–F），而在植株根细胞内部发现了一些细菌细胞（图1G）。荧光假单胞菌接种处理中gfp基因的Q-RT-PCR表明，侧根中gfp基因的表达水平显著高于主根（图1I），高达4.06倍。
图1 通过gfp标记方法观察到的荧光假单胞菌的定殖。A-G：荧光假单胞菌在东南景天根中的gfp荧光定位。H：仅用gfp标记的荧光假单胞菌的观察。A，D：明场图像；B，E，H：gfp荧光；C，F，G：明场和gfp荧光的合并图像。所有照片均通过激光扫描共聚焦显微镜获得。I：BA处理中gfp基因在侧根和主根中的表达水平。误差棒上方的***表示使用单因素方差分析在主根和侧根之间的P <0.001水平有显著差异。
2 荧光假单胞菌促进东南景天的侧根形成
结果表明，细菌接种通常会在根尖部分（图2A–B）和成熟根部（图2C–D）中增强侧根的形成。根扫描分析表明，荧光假单胞菌的接种显著增加了东南景天的总根长（图2E），总表面积（图2F），总根体积（图2G），根尖数（图2H）和侧根数（图2J）。BA处理的东南景天侧根数是CK的1.78倍。但是，两种处理之间的主根数没有明显差异（图2I）。
图2 荧光假单胞菌对根形态的影响。A-B：主根的顶端部分，C-D：主根的成熟区域，所有照片均通过激光扫描共聚焦显微镜获得。E：总根长，F：总表面积，G：总根体积，H：根尖数，I：主根数，J：侧根数。误差棒代表4个重复样本的标准偏差（SD）。误差棒上方的*表示在使用单因素方差分析的CK和BA处理之间在P <0.05水平存在显著差异，**表示在P <0.01水平存在显著差异，***表示在P <0.001水平存在显著差异。
3 Cd离子在东南景天根中的分布
使用特定的Cd离子探针，可以在根的外部（图3A–E）和内部（图3F–G）观察到Cd的分布。观察到侧根（图3B–C），根毛（图3A–C）和主根的根尖（图3D–E）是Cd的吸收部位。其中，新出现的侧根在荧光假单胞菌接种后表达最强的Cd信号（图3B–C）。但是，在两种处理中，主根的根尖都没有表现如此强的Cd信号（图2F–G）。BA处理根中Cd荧光的定量显示，侧根的荧光强度显著高于主根（图2H）。前者和后者之间的荧光强度差异达到1.85倍。
图3 通过特定Cd离子探针观察到的Cd进入。A-C：新出现侧根中观察到的Cd荧光；D-E：在主根的根尖中观察到的Cd荧光；F-G：在主根的横截面中观察到的Cd荧光。黄色箭头表示新的侧根。所有照片均通过荧光显微镜获得。H：BA处理中主根和侧根的荧光强度。误差棒上方的***表示使用单因素方差分析主根和侧根之间在P <0.001水平有显著差异。
4 荧光假单胞菌增加了东南景天的生物量，Cd吸收和积累
荧光假单胞菌接种显著增加了4周处理后的根部干生物量（图4A），Cd浓度（图4B）和积累（图4C）。BA中根中Cd的浓度和积累量分别比CK高1.70倍和2.63倍。此外，接种后茎的干重（图4D），Cd浓度（图4E）和积累（图4F）也显著增强。BA中的茎中Cd浓度和积累量分别比CK高1.33倍和1.87倍。
图4 荧光假单胞菌对生物量，Cd吸收和积累的影响。A：根的干重，B：根的Cd浓度，C：根的Cd积累，D：茎的干重，E：茎的Cd浓度，F：茎的Cd积累。Cd积累量（μg植物-1）=Cd含量（μg g-1 DW）×干重（g植物-1）。误差棒代表4次重复的标准差（SD），*表示在P < 0.05的水平上有显著差异，而***表示在P < 0.001的水平上有显著差异。
5 植物激素相关基因被荧光假单胞菌高度激活
根据RNA序列数据，接种和未接种的处理之间存在39,903个差异表达基因（DEG）。其中，有18,134个基因被上调，而有21,769个基因被下调（图5A）。随机选择10个DEG用于q-RT-PCR验证，结果表明q-RT-PCR和RNA-seq结果高度一致（图5B）。10个DEG的详细信息请见表S1。植物激素信号转导途径被显著激活，这些途径中总共有146个上调基因对荧光假单胞菌接种有响应。最明显的是IAA信号的响应，其次是TZ，BR，ET，ABA，SA，GA和JA信号（表1）。大多数DEG编码植物激素受体蛋白，转运蛋白或转录因子（表1）。为了揭示146个上调基因之间的相互作用，计算了它们成对表达模式的相关系数。然后将相关系数用于可视化共表达网络。结果表明，来自8种植物激素信号通路的119个DEG参与了一个复杂的相互作用网络，在其中获得了1104个关联（图5C）。
图5。在荧光假单胞菌接种后，植物激素相关基因在东南景天根中被激活。A：根中DEG的数目（FDR ＜0.05），红色表示上调的基因，绿色表示下调的基因。B：RNA-seq和q-RT-PCR之间的相关性。C：基因共表达网络。利用植物激素信号通路中146种上调基因的基因表达水平（FPKM）来计算Pearson相关系数。筛选了具有相似表达模式（R> 0.99）的119个基因的网络图谱。共有1104条线，线的颜色表示相关系数。
表1 植物激素信号转导途径中146个上调基因的注释。
注：IAA：吲哚乙酸，TZ：反式玉米素，BR：油菜素内酯，ET：乙烯，ABA：脱落酸，SA：水杨酸，GA：赤霉素，JA：茉莉酸。
6 荧光假单胞菌影响东南景天的植物激素浓度
检测到东南景天根中8种植物激素的浓度。结果表明，在荧光假单胞菌接种后，根中的IAA浓度显著增加（图6A）。BA处理中的IAA浓度比CK处理高1.50倍。ABA，BR，TZ和JA的浓度显著降低（图6B–E）。BA处理的ABA，BR，TZ，JA的浓度分别比CK处理低0.92倍，0.83倍，0.75倍，0.58倍。在BA处理中，ET的释放被显著抑制，并且比CK处理中的释放低0.68倍（图6G）。两种处理之间SA浓度没有明显变化（图6H）。由于含量低，在任何处理中都无法检测到GA3的浓度。
图6 植物激素的浓度。A：吲哚乙酸浓度，B：脱落酸浓度，C：油菜素内酯浓度，D：反玉米素浓度，E：茉莉酸浓度，F：乙烯浓度，G：水杨酸浓度。误差棒代表4次重复的标准偏差（SD），而*表示在P <0.05的水平上有显著差异，**表示在P <0.01的水平上有显著差异，***表示在P <0.001的水平上有显著差异。
1 荧光假单胞菌促进东南景天侧根形成和镉吸收
已有研究表明，Cd流入量随着与小麦，Noccaea caerulescens，Sueda salsa和银灰杨的根尖距离的增加而大大降低。Cd流入量的这种纵向变化可能导致强分枝根系对Cd的吸收更高，这表明侧根的出现对Cd吸收的重要性。在本研究中，荧光假单胞菌的接种增加了东南景天侧根的数量。同时，发现侧根，根毛和主根根尖是Cd吸收的主要部位，在新出现的侧根中信号最强。这与以前的研究一致，该研究基于质外途径，表明新出现的侧根对Cd的吸收是东南景天超富集的重要途径。另一项研究表明，主根的根尖对于东南景天中Cd的吸收也至关重要。但是，本研究与后者不一致，因为荧光假单胞菌对主根的发育和Cd吸收没有明显影响。根据现有的研究，这些研究报告了一些有益细菌物种/菌株在主根发育中的调控作用，作者认为，未来的研究应更多地关注PGPB在超富集植物的主根发育和重金属吸收中的参与。在本研究中，由于荧光假单胞菌促进侧根的形成，从而增加了植物根中Cd的浓度和积累，因此它促进了超富集东南景天对Cd的植物修复效率。因此，可以通过诱导超富集植物的侧根的形成来改善植物修复，这将促进其重金属的吸收。我们的结果表明，PGPB不仅增强了金属转运蛋白的表达，而且还修饰了质外体途径，以促进植物的超富集。
2 荧光假单胞菌定植在新出现的东南景天侧根中
较早的研究表明，PGPB倾向于在植物的新出现的侧根上定殖。例如，带有gfp标签的根瘤菌在水稻中的定殖表明，动态感染过程始于根瘤菌的定殖（特别是在侧根出现时），然后是内生性定殖。此外，对拟南芥根部定殖细菌的CARD-FISH染色表明，新出现的侧根被内生菌严重定殖。同样，在本研究中，荧光假单胞菌的gfp标记表明，荧光假单胞菌特别定殖在新出现的侧根上。而且，接种的荧光假单胞菌改善了根的发育并增加了侧根的数量，从而扩大了PGPB的定殖面积。PGPB也定殖了植物根的其他组织，包括根毛，表皮细胞或木质部导管，这表明植物和PGPB的种间差异在细菌定殖中起作用。本研究中细菌定殖和Cd吸收的荧光观察和定量评估表明侧根在东南景天和荧光假单胞菌之间的相互作用中起着至关重要的作用。目前的研究表明，新出现的侧根可以作为生物和非生物制剂进入超富集植物根系的共同途径。这可能是由于侧根出现期间木栓质发育不完全所致。
3 荧光假单胞菌影响东南景天中植物激素的信号转导
一些PGPB通过调节宿主植物中的激素串扰来促进植物根部生长。这主要是通过吲哚乙酸（IAA）和乙烯（ET）/茉莉酸（JA）信号传导途径之间的相互作用来实现的。但是，已有研究表明某些内生的PGPB可以独立于IAA或ET/JA信号转导途径促进根发育，这意味着其他植物激素也可能参与PGPB诱导的根发育。因此，作者使用全基因组mRNA测序来比较对照植物（CK）和荧光假单胞菌定殖植物（BA）的基因表达之间的差异。结果表明，细菌接种后植物激素信号转导被激活，有146个上调基因。在东南景天和荧光假单胞菌之间的相互作用中涉及的8个植物激素信号中，与水杨酸（SA），赤霉素（GA）和JA信号相比，IAA，反玉米蛋白（TZ），油菜素内酯（BR），ET和脱落酸（ABA）信号被更强的激活。而且，它们维持复杂的共表达网络关系，表明荧光假单胞菌通过激活多激素信号合作来促进东南景天的根发育。
4 荧光假单胞菌影响东南景天中植物激素的生物合成
最近的一些研究表明，接种PGPB可以修饰宿主植物中的内源激素生物合成，并减轻植物重金属（Zn，Cd，Ni）的胁迫。但是，关于PGPB接种改变内源性激素浓度的程度，不同研究之间存在不一致之处。这可能是由于所研究的重金属及其浓度，植物和细菌种类以及植物发育阶段和研究组织的差异所致。例如，在Cd或Ni的暴露下，路德维希肠杆菌和Exiguobacterium indicum的接种增加了水稻中ABA和SA的含量，而伯克霍尔德菌大大降低了Zn处理的芜青中的ABA和SA含量。根据这些可变的结果，难以预测荧光假单胞菌接种后东南景天根中植物激素含量的变化。也很难从RNA-seq数据中鉴定与根分支相关的代谢物，因为基因表达水平的变化并不总是导致代谢物浓度的变化。因此，基于RNA-seq结果，作者进行了靶向代谢组学分析，以确定根中的植物激素含量。结果表明，响应于荧光假单胞菌接种，IAA的浓度显著上调，而ABA，BR，TZ，ET和JA的浓度显著下调。植物激素IAA和TZ是调节侧根生长的主要对立调节剂。侧根形成需要IAA，而TZ与IAA具有拮抗作用。此外，BR通过与IAA的相互作用来调节侧根的发育。低浓度的BR通过增加生长素的运输来促进侧根的形成，而高浓度的BR通过诱导抑制生长素信号的生长素响应性蛋白的表达来抑制侧根的形成。因此，似乎在作者的研究中，降低的BR和TZ浓度与提高的IAA水平同步，从而促进了东南景天的侧根形成和发育。在本研究中，植物防御相关激素ABA，ET和JA对荧光假单胞菌的响应降低，可以进一步解释后者的有益作用，但是其他研究将更全面地解释这些激素的信号转导和浓度变化。在本研究中，作者发现新出现的侧根可以作为PGPB和Cd进入超富集植物东南景天的共同途径。接种PGPB荧光假单胞菌后，东南景天中植物激素响应性基因的表达水平和激素浓度受到显著影响。由于激素的串扰，侧根出现，并且更多的Cd进入了植物根部，这大大提高了东南景天中Cd的吸收。该研究结果突出了超富集植物与其有益细菌之间共生相互作用的双向效益。
概要
