科研│大连民族大学：miRNA和降解组测序确定了miRNA及其靶基因与硫化氢对鲜切苹果的褐变抑制有关（国人佳作）
编译：伊一，编辑：景行、江舜尧。
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表面褐变是鲜切苹果货架期的主要限制因素，硫化氢(H2S)处理能有效抑制褐变。然而，鲜切苹果对H2S反应的分子机制却知之甚少。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小RNA，参与调解生命周期的各个方面的多个关键生物过程。研究者在4℃下从对照和H2S处理0天的鲜切苹果取样(C0和S0)和对照和H2S处理后储存6天后取样(C6和S6)，构建了12个小RNA文库和一个混合降解文库。结果分别在S0 vs C0和S6 vs C6鉴定出9个(3个上调和6个下调)和10个(2个上调和8个下调)差异表达的miRNA(DEmiRNAs)。DEmiRNAs的靶基因是转录因子和功能蛋白。靶向SPL的miR156、靶向NAC的miR164、靶向TCP4、GAMYB和酰基辅酶a结合蛋白4的miR319以及靶向patatin样蛋白2的miR6478可能通过调节ROS、苯丙素和脂质代谢在H2S抑制鲜切苹果褐变中发挥重要作用。这些结果为进一步研究miRNA在调控褐变过程中的作用以及H2S处理抑制褐变的分子机制提供了有价值的信息。
论文ID
原名：miRNA and Degradome Sequencing Identify miRNAs and Their Target Genes Involved in the Browning Inhibition of Fresh-Cut Apples by Hydrogen Sulfide
译名：miRNA和降解组测序确定了miRNA及其靶基因与硫化氢对鲜切苹果的褐变抑制有关
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：4.192
发表时间：2020年7月
通讯作者：胡文忠
通讯作者单位：大连民族大学生命科学学院
DOI号：10.1021/acs.jafc.0c02473
实验设计
结果
1 sRNA测序数据概述
为研究鲜切苹果对H2S处理的响应，研究者构建了12个小RNA文库(4个不同样品×3个重复)，经一系列数据筛选，获得了18-25nt的有效序列。在图S1中总结了unique sRNAs的长度分布，并且12个文库的unique reads在21和24nt处有两个主要的峰。sRNA的长度分布模式与其它苹果组织中报道的不同。例如，长度为21nt的sRNA是苹果果皮中的主要sRNA，而在嫩枝组织、根、花和幼果中，24nt是最丰富的。在本研究中，相同长度的sRNA在不同样本中所占的比例也不同，这可能与这些基因的表达变化有关。
总共鉴定出511个特有成熟miRNA，对应于492个pre-miRNA。所有的miRNAs分为三组:已知miRNA (gp1a)、保守miRNA (gp1b、gp2a、gp2b和gp3)和新miRNA (gp4)。共有251个和194个独特的成熟miRNA，分别属于已知miRNA和保守miRNA(表1)。经过Blastn搜索和序列分析，已知的保守性miRNA共有51个家族。鉴定的最大家族是miR156家族(24个成员)，其次是miR399、miR396、miR159、miR172和miR166，分别有17、16、15、15和12个成员(图1)。在以前的研究中，在成熟苹果果皮中鉴定出201个独特的miRNA序列，它们属于43个苹果miRNA家族。同时，miR156家族也是鉴定的最大家族，这可能暗示了miR156在苹果物种中的基本功能。
表1.比对到miRNA库中选定的miRNA/pre-miRNA的reads。
2 差异表达的miRNA
为探讨H2S处理后鲜切苹果中miRNA的表达模式，采用高通量测序分析评价其表达水平的变化。图2显示S0 vs C0和S6 vs C6分别有9个(3个上调和6个下调)和10个(2个上调和8个下调)差异表达的miRNA。只有一个miRNA (mdm-MIR7121b-p3_1ss15AG)是共有的，在两组中都是上调的。在C6与C0组中，17个(16个上调，1个下调)miRNA差异表达，这些可能是鲜切苹果中与褐变或衰老相关的miRNA。S0 vs C0组和S6 vs C6组的DEmiRNAs都是已知和保守的miRNA。一种新的miRNA在C6组和C0组中差异表达，并被证明是上调的。然后，研究者分析了S6组与C6组、C6组与C0组的DEmiRNA。有趣的是，6种DEmiRNAs(PTC-MiR 6478 _ R-1 _ 1sS 20TC，mdm-MIR159e-p5，vvi-miR171g_L-1R+1，sly-miR167b3p_1ss10AG，mdm-miR10985和mdm-MIR2118a-p5)在两组中都有表达，在S6组和C6组均下调，而在C6组和C0组均上调。
图1.鲜切苹果中的miRNA及其家族数量。
图2.样本间差异表达的miRNA。(a)代表不同文库对中miRNA表达模式的热图。(b)维恩图，显示S0对C0、S6对C6、C6对C0的常见分层。*表明miRNA表达有统计学显著变化，P ≤ 0.05。
3 通过降解组测序鉴定DEmiRNAs的靶基因
为了更好地理解鲜切苹果中鉴定的DEmiRNAs的功能，利用降解组测序技术来鉴定它们的靶标，结果如表S1所示。对于S0 vs C0，DEmiRNAs (mdm-MIR7121b-p3_1ss15AG)没有鉴定到靶，这是S0 vs C0和S6 vs C6的常见DEmiRNAs。然而，在S6 vs C6中，只有两个小分子识别出了目标，而在C6 vs C0中，将近一半的小分子没有鉴别出靶基因。在S6vsC6和C6vsC0的6个常见的DEmiRNA中，只有一个DEmiRNA(vvimiR171g_L-1R+1)鉴定到了靶基因。不同DEmiRNA的靶基因数量各不相同，大多数DEmiRNA调控一个以上的靶基因。靶基因数量最多的两个DEmiRNA是mdm-miR319a_R-1 (20个靶)和mdm-MIR156w-p3 (19个靶)。有趣的是，几个基因被成对的miRNA靶向，如S0vsC0组中的gmaMIR1507c-p5_1ss9AC和gma-MIR1507c-p3_1ss9AC，它们都靶向抗病蛋白RGA2和细胞色素P450 CYP72A219。这两种miRNA可能共同调节基因表达。对于S0vsC0和C6vsC0中的DEmiRNA的目标，一些基因分类为转录因子。例如，发现S0和C0的mdm-miR319a_R-1靶向转录因子GAMYB和TCP2/4，C6和C0的cme-miR172e_R+1靶向乙烯应答转录因子。
为了进一步研究DEmiRNA的可能作用，对S0vsC0、S6vsC6、C6vsC0的靶基因进行了GO分析(图3)。在S0vsC0中，靶基因最多的生物过程包括“转录调节”和“转录”。细胞成分中最丰富的GO项是细胞核。关于分子功能，三个最主要的GO术语是“DNA结合”、“转录因子活性”和“金属离子结合”，在C6vsC0中也发现了类似的富集分析结果。KEGG途径分析表明，“植物激素信号转导”通路中富集了S0vsC0和C6vsC0的大多数靶基因(图S2)。此外，为了在降解分析中解决这些缺失的DEmiRNA的靶基因功能，特别是S6组与C6组和C6组与C0组中的6种常见DEmiRNA，研究者进行了靶基因预测分析。DEmiRNA的许多预测靶点是蛋白激酶，并参与信号转导。一些预测的目标是未知的非特征蛋白质或功能(表S2)。
图3.在S0vsC0 (a)、S6vsC6 (b)和C6vsC0 (c)中对DEmiRNA靶基因的GO分析。
图4.在S0vsC0 (a)、S6vsC6 (b)和C6vsC0 (c)中表达DEmiRNA及其靶基因。*表明靶基因差异表达，log2 |比值| ≥ 1且P < 0.05。
4 miRNA靶基因的表达
为了全面了解H2S处理调控鲜切苹果褐变的miRNA靶标，进行了转录组测序分析。在转录组数据中发现16个DEmiRNA共靶向64个基因，其中只有7个靶基因差异表达(图4)。这些结果表明，靶基因的表达也可能受到其他调节或补偿反馈调节。miRNA通常负调节其目标基因的表达。然而，近46%的靶基因被miRNA正向调控。研究人员推测可能还有其他因素参与了miRNA的调节机制。
图5.H2S处理抑制miRNA介导的褐变的推测模式。红色表示靶基因上调，绿色表示DEmiRNA或靶基因下调，黄色表示编码靶的基因家族上调或下调。
讨论
miRNA作为重要的调节分子，参与植物的正常生理过程以及生物和非生物胁迫响应，已被广泛研究。然而，直到最近，已经进行了相当多的研究来鉴定或比较分析植物中与褐变相关的miRNA和靶标。表面褐变是鲜切苹果货架期的主要限制因素之一，严重影响消费者的购买决策。H2S处理能有效抑制鲜切苹果在贮藏过程中的表面褐变，但miRNA是否参与褐变抑制仍不清楚。在本研究中，miRNA-Seq技术用于分析在4℃下对照和H2S处理的鲜切苹果处理后贮藏0天(C0和S0)和贮藏6天后(C6和S6)的miRNA表达谱。S0组与C0组、S6组与C6组、C6组与C0组分别有9、10和17个显著差异表达的miRNA。S0vsC0和S6vsC6的DEmiRNA数量少于C6vsC0，表明储存时间可能对miRNA表达产生了广泛的影响。每组的成员都不同。在S0vsC0和S6对C6只发现了一个DEmiRNA。这种转录后事件的有限重叠表明受H2S处理影响的miRNA表达模式随着时间的推移而不同。在S6vsC6中下调的6个DEmiRNA在C6vsC0中上调。因此，研究者推测这六种DEmiRNA可能在H2S诱导的鲜切苹果褐变抑制中起重要作用。不幸的是，降解测序结果没有检测到这六个DEmiRNA的目标。生物信息学预测的目标是蛋白激酶、无特征蛋白或功能未知。因此，这些DEmiRNA是否参与了H2S诱导的褐变抑制以及它们如何调控褐变反应需要进一步研究。
总的来说，在S0组vsC0组和S6组vsC6组中，下调的DEmiRNA比上调的多，这表明H2S处理倾向于抑制miRNA的表达。然而，相反的表达模式出现在C6vsC0组。研究者推测，随着贮藏时间的延长，褐变相关的miRNA被激活，从而加剧了鲜切苹果的褐变。H2S通过抑制这些与褐变相关的miRNA的表达来抑制褐变。还要其他研究者发现，在褐化过程中，褐化相关miRNAs的上调幅度大于下调幅度。然而，在丝瓜中发现的与褐变相关的保守miRNA，如miRNA477、miRNA169、miRNA396、miRNA171、miRNA399和miRNA858、本研究数据中没有发现。其他与褐变相关的miRNA，即针对多酚氧化酶基因的miRNA528，在冷胁迫下香蕉果皮褐变中起着重要作用，在S0vsC0、S6vsC6或C6vsC0组中没有差异表达。这可能是由于不同的植物种类、不同的胁迫或切割操作改变了miRNA的表达模式，因为发现许多miRNA对伤害有反应，并在防御反应的调节中起重要作用。此外，在拟南芥中报道的H2S诱导的miRNA，如miRNA167和miRNA396，在S0对C0和S6对C6组中没有检测到。因此，可以假设H2S反应的miRNA可能是物种特异性的。为了进一步阐明miRNA在H2S诱导的鲜切苹果褐变抑制中的调控功能，研究者采用降解组测序技术检测了miRNA的靶标。然而，在S0vsC0、S6vsC6和C6vsC0组中，近一半的DEmiRNA没有鉴定出目标基因，这可能是由于鲜切苹果的低表达水平和/或特定的褐变调节途径。先前的研究还发现，并不是所有的miRNA的目标基因都可以通过降解测序来鉴定。
在这项研究中，研究者发现一些DEmiRNA靶向转录因子家族中的基因，如SPL、NAC、GAMYB和TCP。在植物中，靶向SpL的miR156是高度保守的，在植物发育中起着许多重要作用。还报道了靶向miR156的SPL参与次级代谢物的合成和活性氧代谢。在拟南芥中，上调miR156的表达导致高水平的花色素苷，而下调miR156的表达促进黄酮醇的积累。miR156靶向的SPL9负调节ROS的积累和抗氧化酶的表达和活性。在本研究中，csi-miR156f5p_1ss12GT针对一个由八个SpL组成的基因家族。csi-miR156f-5p_1ss12GT的显著降低可能增加黄酮醇的合成，提高鲜切苹果的抗氧化活性，这可能与H2S处理抑制褐变有关。
NAC转录因子是植物中最大的转录家族之一，在植物发育和防御反应中起着重要作用。在八种水果中发现了体内抑制NAC转录因子表达的miR164，这与水果成熟调节有关。转录因子基因DgNAC1的过量表达提高了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶的活性，降低了活性氧和丙二醛的积累，从而提高了菊花的耐盐性。其他研究表明，苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)活性与NAC表达呈正相关。因此，H2S处理后mdm-miR164b的低水平表达增加了NAC的表达，可能提高了鲜切苹果的抗氧化活性，这可能与抑制褐变有关。
但真空包装延缓鲜切莲藕褐变的情况不同， NnNAC1/4被显著抑制，而NnNAC2被诱导。这种差异可能是由物种特异性NAC成员造成的，因为NAC的功能可能与其类型和植物物种有关。
据报道，转录因子GAMYB(赤霉素和脱落酸调节的MYB)通过调节PAL的表达参与花药发育。MYB参与了荔枝果皮和丝瓜果实褐变的调控。本研究中，研究者推测mdm-miR319a_R-1调控的GAMYB也可能参与了H2S处理对鲜切苹果褐变的抑制。mdm-miR319a_R-1靶向的另一个转录因子是TCP，参与叶片形态发生衰老、花发育等多种生物过程。在拟南芥中，TPC4由miRNA319a转录后调节，并通过正向调节脂氧合酶2 (LOX2)的表达来影响茉莉酸(JA)的合成。mdm-miR319a_R-1的过表达通过降低TCP4的表达而延缓叶片衰老。在这里，研究者发现H2S处理下调了鲜切苹果中mdm-miR319a_R-1的表达，其中一个编码TCP4的靶基因上调，另一个下调。然而，大量研究表明，H2S控制鲜切水果的褐变，并伴随着LOX活性的降低。除了转录因子外，还鉴定出mdmmiR319a_R-1靶向酰基辅酶a结合蛋白4 (ACBP4)，其通过转移酰基辅酶a酯参与脂肪酸生物合成。此外，另一个脂质代谢相关基因patatin样蛋白2 (PLP2)，其可催化膜脂质的水解，被ptc-miR6478_R-1靶向。因为脂质是细胞膜的基本成分，膜脂质组成的任何改变都可能改变生物物理和/或生化膜的性质，破坏膜的完整性，最终加剧褐变。值得注意的是，mdm-miR319a_R-1和ptcmiR6478_R-1都受到H2S处理的抑制，但它们的靶基因也受到下调。因此，mdmmir 319 a _ R-1-靶向GAMYB、TCP4和PLP2以及PTCMIR 6478 _ R-1-靶向PLP2在H2S处理抑制鲜切苹果褐变中如何调节苯丙素代谢和脂质代谢仍需进一步研究。
此外，DEmiRNA的一些靶基因被注释为功能蛋白。例如，gma-miR1507被发现靶向与次级代谢相关的抗病蛋白和细胞色素P450。因此，H2S处理的鲜切苹果中gma-miR1507水平的降低可能改善防御反应，从而延缓褐变。在C6vsC0组中，与能量代谢相关的ABC转运蛋白被证明是PC5p-10846_143的靶基因。鲜切苹果贮藏过程中PC-5p10846_143表达上调可能降低能量水平，并可能加剧褐变。总之，本研究描述了miRNAs在鲜切苹果H2S控制褐变中的作用，在S0组与C0组和S6组与C6组中共鉴定出18个miRNAs。大约74%的小RNA被H2S下调。降解结果表明，miRNA的靶基因是转录因子和功能蛋白，如转录因子SPL和NAC、酰基辅酶a结合蛋白和patatin样蛋白。研究者推测，miRNA及其靶基因可能通过调节活性氧、苯丙素和脂质代谢参与了H2S处理对鲜切苹果褐变的抑制(图5)。该研究结果为进一步探索miRNA在鲜切水果褐变调控中的作用以及深入理解H2S处理抑制褐变的分子机制奠定了基础。
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