荧光定量小课堂丨这么实用的曲线图分析法怎么可以不学！——熔解曲线分析
说起曲线图，一直都是小编心中的痛。因为每次看到它们，小编就会想起学生时代的噩梦——函数。
就是这种“恐怖”的图
从小学开始被各种函数虐得体无完肤，譬如：常年保持“抛物线”形状的二次函数、总是“大起大落”的三角函数、喜欢“四仰八叉”的幂函数……面对这些形态各异的曲线，小编常常觉得各种懵逼茫然，甚至有“如履薄冰”之感。后来，好不容易从学校毕业了，以为终于要解脱了，结果进了实验室又遇上了熔解曲线，word天！
但最让小编震惊的是，用“熔解曲线分析法”来检测“实时荧光定量 PCR”的实验反应，偏偏又直观、清晰得很！大家要是不相信的话，不妨来看看小编整理的资料呗~
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熔解曲线图示了随着反应温度的升高，当结合染料分子的双链DNA(dsDNA)解离或“熔解”成单链DNA (ssDNA)时，观察到的荧光强度的变化。例如，当加热结合有SYBR® Green I 染料的双链DNA 时，其达到熔点 (Tm) 后，由于DNA 链的解离和染料的释放，检测的荧光强度会出现突然下降。绘制荧光强度与温度图 (图1A)，及-ΔF/ΔT(荧光变化/温度变化) 与温度图，清晰显示熔解曲线动态范围 (图1B)。
A.
B.
图 1. 熔解曲线 (A) 和 -ΔF/ΔT 与温度 (B)。
扩增后熔解曲线分析是一种简单、直接地检查实时荧光定量PCR 反应中引物二聚体结构的方法，可确保反应的特异性。由于核酸的熔解温度受长度、GC 含量以及是否存在碱基错配等因素影响，不同的PCR 产物通常可根据其熔解特性区分。通过熔解曲线分析鉴定反应产物(如引物二聚体与扩增片段) 省去了耗时的凝胶电泳步骤。
图2所示的典型的实时荧光定量 PCR数据组显示了上文提及的多个术语。图2A显示了典型的实时荧光定量 PCR 扩增曲线。在早期PCR 反应循环中，荧光信号变化极小。随着反应的进行，每个循环的荧光水平开始增加。将反应阈值设置在基线之上、曲线的指数期部分。该阈值可用于指定每个扩增反应的阈值循环或Ct 值。利用一系列含有已知量靶点的反应的Ct 值生成标准曲线。将未知样本的Ct 值与此标准曲线相比较进行定量，或者在相对定量时采用标准曲线检验效率。Ct 值与起始模板量呈反比：反应中的起始模板量越高，反应的Ct 值越低。
A.
B.
图 2. 1.25 x103 至 2 x104 个拷贝的 RNA 酶 P 扩增。 在 ViiA™ 7 实时荧光定量 PCR 系统的标准热循环条件下，采用 FAM™ 染料标记的 TaqMan ™ Assay 及 TaqMan™Universal Master Mix II 对 2 倍连续稀释的人 RNA 酶 PDNA 进行实时荧光定量 PCR 反应。(A) 扩增曲线。(B) 标准曲线显示了模板拷贝数与阈值 (Ct)。
图2B显示了利用扩增曲线的Ct 值生成的标准曲线。标准曲线提供了扩增效率、重复一致性及反应的理论检测限等信息。
熔解曲线分析只适用于扩增片段上保留荧光基团的实时荧光定量PCR检测技术。采用SYBR™ Green I 或SYBR™GreenER™染料的扩增可进行熔解曲线分析。双重标记探针检测系统 (如TaqMan™探针) 不适用，因为该系统可在PCR 过程中剪切并释放荧光基团至溶液中，产生不可逆的信号变化；但该方法具有更高的特异性，因此不会带来严重的影响。
SYBR™ Green I和SYBR™ GreenER™ 染料与dsDNA 结合后，荧光水平大幅增加。通过监测dsDNA 的熔解将会观察到，随着DNA 变为单链且染料从DNA 上解离，荧光强度逐渐下降。
实时荧光定量 PCR 分析的特异性取决于使用的引物及反应条件。但即便是设计极佳的引物亦可能形成引物二聚体或扩增出非特异性产物 (图3)。当包含基因组DNA 的RNA 样本进行qRT-PCR 时，基因组DNA 也有可能被扩增。可采用熔解曲线分析确认实时荧光定量PCR 反应的特异性。当无法进行熔解曲线分析时，必须更加注意不同反应之间观察到的Ct 值差异是否有效，且不是由于存在非特异性产物造成的。
图3. 熔解曲线分析可用于检测是否存在非特异性产物 (如引物二聚体)，如图所示，熔解曲线中扩增产物峰的左侧有其它的峰。
当两个PCR引物 (同义引物或正义和反义引物) 相互结合，而非与靶点结合时，即形成引物二聚体。引物二聚体的熔解温度较扩增片段更低，采用熔解曲线分析可鉴别是否存在引物二聚体。包含模板的样本中最好无引物二聚体存在，因其会降低PCR 效率并影响分析。无模板对照(NTC) 中最易形成引物二聚体，因其中包含大量的引物且无模板存在。NTC 中存在引物二聚体时，用户应注意包含模板的反应中也可能有引物二聚体存在。如果NTC 中存在引物二聚体，则应重新设计引物。对NTC 的熔解曲线分析，可以将引物二聚体与由试剂组分中污染的核酸造成的假性扩增区分开来。
要进行熔解曲线分析，应对实时荧光定量PCR仪进行编程，在热循环实验方案结束后显示熔解曲线。扩增完成后，仪器将重新加热您的扩增产物，为您提供完整的熔解曲线数据 (图4)。大多数实时荧光定量PCR 仪平台已将该特性整合至其分析软件包内。
图4. Applied Biosystems™仪器上的熔解曲线热学特性设置示例 (快速加热至 94°C，变性 DNA，然后冷却至 60°C)。