6+单细胞测序结合湿实验的新思路
导语
今天和大家分享的是2020年2月份发表在cancers (Basel)杂志上的一篇文章(IF=6.126)“Comparative Molecular Analysis of Cancer Behavior Cultured In Vitro, In Vivo, and Ex Vivo”。文章中作者对不同培养（体内、体外）条件下纯化的癌细胞的比较研究表明，癌细胞的表型高度受其微环境的影响，不同的培养条件下几个关键生物学过程（细胞周期进程，ECM重塑，细胞信号传导和EMT进程）也各不相同。作者发现类瘤表现出与同系小鼠中建立的体内肿瘤最相似的特征，并进一步通过scRNA-seq评估了类瘤细胞成分因此提出需要继续改善3D培养条件，以保留基质成分和EMT多样性，以便将来的药物筛选可以识别出阻止癌症发展的疗法。
Comparative Molecular Analysis of Cancer Behavior Cultured In Vitro, In Vivo, and Ex Vivo
体内培养（In Vivo）和体外培养（In Vitro,Ex Vivo）的癌症特征的分子比较分析
一、研究背景
人类癌细胞系体外（2D）培养已成为癌症生物学研究以及筛选和评估抗癌药治疗效果的基础，但不能很好地模拟患者体内肿瘤进展。相比起来，实验室的3D培养具有增强的细胞异质性，但不能结合复杂的异质细胞组成以及体内发生的营养物或药物的扩散。患者异种移植肿瘤模型PDXs缺乏完整的免疫系统会使人类肿瘤以特异性方式进化，这些模型对于测试许多基于免疫的疗法无效。同种异体移植啮齿动物模型代表了临床上最相关的癌症模型，但利用小鼠来源的癌细胞系或能够自发产生肿瘤的遗传小鼠模型的动物模型的研究结果，小于8％被成功地转换为临床癌症试验。由于易于培养以及类瘤维持基质细胞复杂性的能力，来自原发性临床肿瘤（类瘤）的异质离体类器官培养物获得了可观的发展。类瘤允许更快的培养方法，适合在临床前设置中对多种分析工具进行多方向复用。一些研究表明类瘤培养结果有希望跨越多种癌症类型。然而，作为培养方法的产物，对于其基质细胞群及其对癌细胞行为的影响的透彻分析尚待深入研究。
二、研究思路
三、结果解读
1.癌细胞转录组取决于培养条件
作者首先检查了与肿瘤进展相关的生物学过程的差异表达，以判断不同培养条件对行为的影响。作者对不同培养方式生长的4T1细胞进行RNA测序来确定由培养环境的分子表型。使用的体外方法包括在聚苯乙烯组织培养物处理的烧瓶上进行常规2D 4T1单层培养，在初始培养4天形成球体（3DM）后，将球状体置于非贴壁孔板中培养7天，或将球状体包裹在明胶-纤维蛋白水凝胶(3DG)中培养7天。体内方法需要使用生成表达的蓝色荧光蛋白（BFP）的4T1细胞，再进行FACS分选获得了高BFP（蓝色荧光蛋白）表达的细胞，最后将4T1-BFP细胞接种到免疫缺陷（NSG）小鼠的原发性肿瘤和同源的具有免疫能力的（BALB/c）小鼠中。本研究分析了从免疫缺陷(NSG)小鼠原发肿瘤和同基因免疫能力(BALB/c)小鼠模型中分离的癌细胞的转录谱。虽然将恶性细胞接种到起源组织中是复制原生基质环境的理想方法，但皮下注射肿瘤细胞提供了一种技术上可重复性和简单的方法来将癌细胞引入体内。在这里，我们全面研究了原发肿瘤在乳腺脂肪垫（MFP）和皮下（SQ）位点的定位所带来的转录效应。
通常单层培养(2D)癌细胞，因此以2D培养的转录谱作为参考，鉴定了每种培养方法中的差异表达基因（DEG）。分选的Balb/c来源的MFP (SBM)培养代表了最具临床相关性的肿瘤来源的癌细胞模型，因为其癌细胞是从原位纯化的，且肿瘤是在小鼠免疫耐受菌株中生长的。接下来可成功再现原生癌细胞并将之与SBM样本进行比较。从组织学上讲，体内4T1-BFP +肿瘤比在球体中培养的4T1细胞具有更密集的细胞，图1G显示了标记的4T1细胞被其他基质细胞类型包围（绿色），肌动蛋白（红色），DAPI（蓝色）。
图1. 实验概述
4T1 MFP（全肿瘤BALB / c乳腺脂肪垫（TBM））和SQ（全肿瘤BALB / c皮下脂肪（TBS））的转录本与2D培养细胞差异最大，但它们显示出高度相似性。与2D细胞相比，全肿瘤的RNA产生了最多的DEGs，这可能是由于MFP、SQ培养中基质细胞差异引起的。然而，这些基因与4T1细胞独有的变化并不相关，因为从这些肿瘤中分离出来的4T1- bfp +的转录本仅有1251/2604(48%)上调，336/1385(24%)下调的基因重叠。
图2. 在不同培养条件下癌细胞的转录组变异性
BALB / c MFP（SBM）和SQ（SBS），NSG MFP（SNM）和SQ（SNS）肿瘤的体内内分选的BFP + 4T1细胞与其自身聚集最紧密，但3D球体诱导了更高水平的体内样转录水平。原位MFP和SQ肿瘤的4T1-BFP +细胞在有免疫能力和免疫缺陷的小鼠中表达高度相似（与2D相比，在差异表达基因的数量和一致性上差异极小）。MFP和SQ肿瘤在具有免疫能力和免疫缺陷的小鼠中分别有79%和83%的DEGs。免疫缺陷确实增加了4T1细胞内独特的基因表达变化，其中BALB/c中生长的4T1- bfp +细胞(SBM)和NSG小鼠中生长的细胞(SNM)只有1993/2604上调(75%)和1017/1385下调(73%)的DEGs重叠。
进行GO和通路富集分析发现同系小鼠中的4T1-BFP +细胞上调了一系列与细胞过程相关的基因，这些基因表明细胞与周围微环境的分化和相互作用（表1）。
表1. 从原位和同源4T1小鼠肿瘤中分离出来的2D与癌细胞中高表达基因本体
在所有体内条件下，ECM的组织，免疫应答，细胞信号传导以及细胞的极化和迁移都是富集到的功能类别。相对于vivo-derived的癌细胞，单层培养的细胞促进了一系列涉及细胞增殖多个方面的细胞过程，例如DNA合成，RNA加工，蛋白质翻译以及细胞周期进程，表明2D培养的细胞促进增殖。
2 培养条件影响对癌症进展至关重要的癌细胞行为
作者进一步检查了与肿瘤进展相关的生物过程的差异表达，以了解不同培养条件所带来的行为影响。因为细胞周期进程的失调是癌症开始的标志，也是众多化疗治疗的靶点。然而，细胞代谢的改变也需要癌症的进展，包括细胞外基质重塑，通过分泌的细胞信号转导，以及上皮间质状态的转变。
与增殖和细胞分裂相关的基因在2D中高度表达，但这些基因表达在体内肿瘤中纯化的4T1细胞中最少。这涉及与细胞周期相关的相对于2D在SBM中下调的88个基因，包括几个细胞周期蛋白转录物（Ccna2，Ccnb1，Ccnd2，Ccne2）。3DG和3DM均显示细胞周期基因的适度表达，从体内肿瘤分选出来的细胞显着抑制该基因集。在单层中细胞中大量表达的基因也在促进生长和细胞分裂的生物过程，包括DNA合成，RNA加工和核糖体翻译。如参与有丝分裂功能（Ccp110，Npm1，Cdc6，Cdc25a）和DNA复制（Fen1，Orc1，Orc2）在2D中显著上调。22种细胞周期相关的基因，包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1a（Cdkn1a），细胞周期进程的调节因子和泛素-蛋白酶体系统成员（Ubb，Ubc，Psmb8，Psmb9，Psmb10，Psme1，Psme2）在体内以较高水平表达。具体而言，与人类增殖性胚胎干细胞（hESC）相关的免疫蛋白酶（Psmb8-10）是体内表达最高的细胞周期基因之一，表明体内干性相关基因上调。细胞周期过程不仅在转录水平受到调控，还包括严格控制的翻译和翻译后调控。在单层培养中观察到磷酸化的Cdk1（1种有丝分裂进程的调节因子）和磷酸化的Mcm2(一种s期进展的调节因子)水平上调。这些细胞周期基因在3D培养的细胞中表达降低，在体内培养的细胞中表达极低。
肿瘤ECM和周围组织的结构和重塑是肿瘤发生，外渗和内渗的重要方面，可使疾病进展。单层生长的4T1细胞的核心基质基因表达较低（包括胶原蛋白，Ern，Bgn，Dcn，纤蛋白和原纤维蛋白）；与ECM调节相关的基因和细胞基质粘附。相比之下，这些基因在体内和3D培养中有稳定表达，表达水平显著高于ECM相关基因。尽管ECM相关基因在所有体内和3D模型中均上调，但大量ECM基因在同系小鼠（SBM）中上调水平最高，而在免疫缺陷动物（SNM）中则下降了。在水凝胶中培养的球体确实促进了培养基中培养的球体中核心基质和ECM调控基因的适度上调，高于培养基中培养的球形细胞的水平，因此表达水平更近似于体内条件细胞行为。
图3. 在单层培养中细胞周期进展基因上调
接下来作者通过流式细胞仪验证了两个ECM调节剂（基质金属蛋白酶ITGAM和ITGA4）的蛋白质表达，ITGAM蛋白表达随培养复杂性增加而增加，其中2D培养的细胞表达最低，SBM表达最高，与转录数据保持一致。但3DM样品无法检测到蛋白质。
图4. 3D和体内条件下培养的细胞外基质组织基因被上调
癌细胞的许多行为变化（包括增殖，运动和免疫相互作用）都可以追溯到回细胞信号通路的激活。无监督聚类分析识别了几种细胞信号通路（RAS，TNF，PI3K-AKT，MAPK，干扰素和白介素）在体内条件下显着上调，但在3D条件轻度上调。具体而言，干扰素α和β（IFNα/β）和干扰素γ（IFNγ）和白介素的信号传导在免疫能力的小鼠（SBM）中显著上调。这种作用在免疫缺陷小鼠(SNM)中显著降低，并且在3D培养的癌细胞中，对于IFNα/β和IFNγ信号传导，上调幅度最小。令人惊讶的是，在所有条件下，两个IFNα/β受体亚基（IFNAR1和IFNAR2）均表现出轻度上调（分别为1.47±SD 0.165和1.84±SD 0.93）。但仅从同基因肿瘤分离的癌细胞中看，包括IRF转录因子（Irf1，Irf2，Irf4，Irf7，Irf8，Irf9）以及干扰素靶基因（Ifi27，Ifi35，Ifit1，Ifit3，Ifitm1，Ifitm3，Isg15，Isg20）下游靶点显著上调。
图5. 同源培养条件下细胞信号高度上调
相对于2D，IFNγ通路基因在同基因条件下培养的癌细胞中也表现出最大的表达，在体内免疫缺陷条件下轻度上调，而在3D条件下IFNγ通路基因则最小幅度上调。尽管在SBS和SBM条件下IFNγ受体没有上调，但是相对于2D培养，β-微球蛋白（B2M）（IFNγ信号的下游靶标）在BALB / c肿瘤中上调了9.03倍，a> 3.5X高于其他所有条件，表明癌细胞在同基因条件下显着上调IFNγ通路。流式细胞仪分析的蛋白质水平定量证实，完全感受性免疫系统促进B2M，在NSG小鼠或3D条件下B2M激活最小。与干扰素信号转导一致，白介素信号转导相关基因仅在凝胶或培养基中的3D培养中受到微弱刺激，这些结果都说明了基质细胞和免疫细胞参与体内癌症细胞信号转导的重要性。
STAT复合物作为关键转录因子，介导IFNα/β和IFNγ信号的基因表达。在转录上，Stat1和Stat2在基因条件下均高表达。然而，磷酸化导致STAT复合物易位到细胞核中，在那里它们结合DNA并激活靶基因。为了检测这两个信号通路的激活，量化了4T1细胞中磷酸化的Stat1 (p-Stat1)水平作为干扰素信号的指标。与转录水平一致，仅在BALB / c衍生的癌细胞中观察到pStat1水平显著增加。
信号从上皮到间充质表型（EMT）过渡的关键途径包括通过细胞周期进程抑制增殖，增加ECM重塑和刺激细胞信号传导。最近，Pastushenko等人发现存在多种与不同EMT状态相关的癌细胞亚群，它们在不同的阶段包括：early hybrid, hybrid, late hybrid和mesenchymal states。为确定由各种培养条件诱导的细胞EMT状态，作者首评估了已知与EMT相关基因的表达水平。4T1单层细胞表达高水平的上皮标志物有Cdh1和Esrp，低水平的间质标志物有Mmp19和Vim。此外，4T1单层表达低水平的EMT相关转录因子有Snai1，Zeb1和Twist1。相比之下，EMT标记Krt14，Trp63和Grhl2仅在体内条件下显著上调。但是，晚期杂交Smad3和间充质标记Mmp19在3D和体内条件下均显著上调，这表明体内肿瘤处于更多样化的EMT混合状态。通过细胞周期进程抑制增殖，增加ECM重构和刺激细胞信号通路，是从上皮-间充质表型（EMT）转变的标志。
基于上述方法，流式细胞仪分析用于进一步探究2D和3D培养诱导的EMT状态的异质性。上皮表型的丧失主要通过Epcam表达的丧失来检查。与转录数据一致，单层细胞在主要维持维持上皮状态，只有3.6％的细胞接受EMT。3D培养的样品增加了细胞进行EMT的频率。但从单层培养来看这种增加不具备统计学意义。另外，没有观察到封装水凝胶中差异（介质中为15.8％，凝胶中为14.6％）。在体内条件下，这些细胞的丰度显著增加(27.5% SNM, 32.1% SBM)，免疫缺陷和免疫耐受宿主之间无显著差异。
图6. 体内的4T1细胞处于多种上皮-间充质转化（EMT）状态
此外，根据细胞表面标记物CD51，CD61和CD106的存在，进一步分析EMT的细胞的杂交状态频率。过渡性混合EMT状态分为以下逐步增多的间充质亚群：（1）early hybrid（三阴性或CD106+）（2）hybrid（CD51+或CD51+/CD106+）（3）late hybrid（CD51+/CD61+ ）（4）间质状态（CD51+/CD61+/CD106+）。体外培养比体内培养有更多的间充质细胞丰度，而体内培养的细胞具有丰富的early hybrid亚群。而免疫缺陷肿瘤中early hybrid EMT细胞丰度的增加和late hybrid EMT细胞丰度的降低表明，EMT受到了免疫系统调节。
3 含有基质细胞的体外类肿瘤模型保留了体内模型的肿瘤特征
正如改变的细胞信号过程和EMT分布在RNA和蛋白质水平，基质复杂性会影响癌细胞的行为。然而，用细胞系体外研究通常不包括基质细胞。为了检验基质细胞在体外的作用，在流式细胞仪对癌细胞进行转录组分析之前，将肿瘤细胞匀浆作为单层或球状培养5天，然后进行了FACS筛选，以进行转录组分析。与同质SBM条件相比，基质成分的掺入增加了4T1总体转录组学相似性，其中离体单层（EV2D）和球体（EV3D）与体内衍生的4T1细胞相比，更相似于任何其他4T1体外方法。在体外和体内不同条件下区分4T1转录组的硅层次聚类，掺入类肿瘤培养物可使EV3D更接近体内条件，而EV2D与体外条件更相似。
图7. 离体类肿瘤培养物促进类体内癌细胞行为
之前描述的关键癌症过程的离体基因调控研究进一步支持了总体转录组分析，即与EV2D或同质体外培养相比，EV3D类瘤在细胞周期，ECM和细胞信号转导方面最能保留体内特征。EV2D样品改善了ECM和细胞信号转导基因的体内基因表达相似性。然而，离体培养5天后，细胞周期基因恢复到单层样表达水平。肿瘤培养物中基质细胞的存在也保持了较高的癌细胞EMT多样性。然而，离体培养迅速促使EMT细胞进入更间充质状态，并减少了处于过渡性EMT状态的细胞的频率，因为两种类瘤情况都产生了更多处于间充质状态的EMT细胞（EV3D：49％，EV2D：35％）。与仅在3D模式下培养的4T1相似。晚期混合种群也显着低于同系肿瘤（EV3D：17％，EV2D：7％）。令人惊讶的是，EV2D保持了较高的早期混合EMT细胞率（48％），而EV3D频率降低了（22.5％）。
尽管含有基质细胞的体外类瘤模型保留了体内模型的肿瘤特征，但仍与体外模型表现出一定的相似性，作者假设这是类瘤模型丧失了部分的细胞亚群引起的。为了研究肿瘤和类瘤成分的差异，利用scRNA-seq比较3D类瘤培养物中的细胞异质性（图8 A）。在离体培养的5天中，癌细胞的数量增加了一倍以上，使肿瘤细胞的比例从收获的肿瘤中的24.7％增加到类肿瘤中的59.7％。通过流式细胞术验证了离体癌细胞群体的扩增，并在2D和3D条件下均进行了观察。更具体地说，离体培养使Epcam + / Mki67 +癌细胞从总细胞的7.4％扩增到30.1％。成纤维细胞占原始肿瘤的8.0％，体外培养使其扩大至类瘤的16.0％。特别是肌成纤维细胞(Thy1+/Dcn+/Acta2+(αSMA))占原始肿瘤细胞总数的4.8%，增加到类瘤细胞总数的15.9%
图8. 4T1肿瘤和类瘤培养物的单细胞RNA-seq分析
4T1同源肿瘤具有高度免疫（Ptprc / CD45 +）浸润，富含骨髓源性中的中性粒细胞（3.4％）和单核细胞/巨噬细胞（55.9％）。在离体培养过程中，这些种群分别减少到1.2％和18.1％。此外，单核细胞/巨噬细胞丰度的损失主要归因于炎症巨噬细胞（Ptprc + / CD14 + / Il1b +）的损失，在体外培养后从肿瘤的27.9％减少至0.3％，而抗炎和增殖的骨髓细胞在类瘤培养物中分别保持可比的比率，分别为17.0％和3.4％。在两种情况下，离体培养后，T细胞/NK 细胞、内皮细胞的比例保持不变。这些结果提示类瘤迅速转变为间充质状态的潜在原因可能是通常抑制上皮向间充质转化的基质细胞类型的耗竭，尤其是炎性巨噬细胞的减少。
四、小结
本文中作者首先在各种培养环境（体外体内）中检查了三阴性乳腺癌小鼠细胞系4T1的转录组，转录组谱分析揭示了分子标记的差异。紧接着对肿瘤进展至关重要的几个关键生物学过程进行分析，类肿瘤代表与同系小鼠中建立的肿瘤最相似的体外方法，保留了进行EMT的细胞的更高丰度。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行类瘤成分评估，类瘤成分在离体培养5天后仍显示出基质亚群的显著变化，因此维持相似的EMT异质性以及包含基质亚群来改善体外培养系统并保留类似的肿瘤成分，这对于了解现有培养方式中的关键缺陷以及重建内源性肿瘤结构和治疗的方面至关重要。
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