简单使用DESeq2/EdgeR做差异分析 | KeapNotes blog

DESeq2和EdgeR都可用于做基因差异表达分析，主要也是用于RNA-Seq数据，同样也可以处理类似的ChIP-Seq,shRNA以及质谱数据。

这两个都属于R包，其相同点在于都是对count data数据进行处理，都是基于负二项分布模型。因此会发现，用两者处理同一组数据，最后在相同阈值下筛选出的大部分基因都是一样的，但是有一部分不同应该是由于其估计离散度的不同方法所导致的。 ### DESeq2的使用方法：

  1. 输入矩阵数据，行名为sample，列名为gene；DESeq2不支持无生物学重复的数据，因此我选择了2个样本，3个生物学重复的数据；并对count data取整（经大神指点，这里需要说明下，我的测试数据readcount是RSEM定量的结果，并不是常见的htseq-count的结果，所以count值会有小数点，而DESeq2包不支持count数有小数点，所以这里需要round取整）。

    database_all <- read.table(file = "readcount", sep = "\t", header = T, row.names = 1) database <- database_all[,1:6] type <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3))) database <- round(as.matrix(database))

  2. 设置分组信息以及构建dds对象

    condition <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3))) coldata <- data.frame(row.names = colnames(database), condition) dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData=database, colData=coldata, design=~condition)

  3. 使用DESeq函数进行估计离散度，然后进行标准的差异表达分析，得到res对象结果

    dds <- DESeq(dds) res <- results(dds)

  4. 最后设定阈值，筛选差异基因，导出数据

    table(res$padj <0.05) res <- res[order(res$padj),] resdata <- merge(as.data.frame(res), as.data.frame(counts(dds, normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE) write.csv(resdata,file = "LC_1_vs_LC_2.csv")

EdgeR的使用方法：

  1. 跟DESeq2一样，EdgeR输入矩阵数据，行名为sample，列名为gene；DESeq2不支持无生物学重复的数据，因此我选择了2个样本，3个生物学重复的数据。

    exprSet_all <- read.table(file = "readcount", sep = "\t", header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE) exprSet <- exprSet_all[,1:6] group_list <- factor(c(rep("LC_1",3), rep("LC_2",3)))

  2. 设置分组信息，去除低表达量的gene以及做TMM标准化

    exprSet <- exprSet[rowSums(cpm(exprSet) > 1) >= 2,] exprSet <- DGEList(counts = exprSet, group = group_list) exprSet <- calcNormFactors(exprSet)

  3. 使用qCML（quantile-adjusted conditional maximum likelihood）估计离散度（只针对单因素实验设计）

    exprSet <- estimateCommonDisp(exprSet) exprSet <- estimateTagwiseDisp(exprSet)

  4. 寻找差异gene(这里的exactTest函数还是基于qCML并且只针对单因素实验设计)，然后按照阈值进行筛选即可

    et <- exactTest(exprSet) tTag <- topTags(et, n=nrow(exprSet)) tTag <- as.data.frame(tTag) write.csv(tTag,file = "LC_1_vs_LC_2_edgeR.csv")

Summary

以上我主要针对单因素两两比较组进行差异分析，其实DESeq2和EdgeR两个R包都可以对多因素进行差异分析。

  1. DESeq2修改以上代码的分组信息design参数以及在差异分析results函数中添加所选定的分组因素，其他代码基本一样，具体参照DESeq2手册

  2. EdgeR则需要用Cox-Reid profile-adjusted likelihood (CR)方法来估算离散度，y <- estimateDisp(y, design)或者分别使用三个函数（y <- estimateGLMCommonDisp(y, design)，y <- estimateGLMTrendedDisp(y, design)， ）y <- estimateGLMTagwiseDisp(y, design)；然后差异表达分析也跟单因素分析不同，主要使用generalized linear model (GLM) likelihood ratio test 或者 quasi-likelihood(QL) F-test，具体代码可以参照EdgeR手册。

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