PCR反应关键步骤

PCR 反应在预变性之后就进入一个重复过程，这个重复过程主要包括三个关键步骤，模板的加热变性、引物与单链模板的复性以及在热稳定DNA聚合酶的作用下复制延伸。整个重复过程结束后可选择增加终延伸，主要是对产物不完整末端的填补，确保全长复制以及高目标DNA片段的得率，同时，Taq DNA聚合酶的“加A尾”反应也在此步进行。

变性

1，预变性

通常预变性温度为94 ℃-98 ℃，反应时间一般1-10 min。根据DNA聚合酶不同选择适合的预变性温度及反应时间是PCR反应顺利进行的关键，充分的预变性有利于DNA双链的打开。高GC等复杂模板，根据DNA酶的耐热性情况可适当提高预变性温度。

2，变性

通常变性温度为94-98 ℃ 孵育10-60 s，取决于DNA聚合酶的耐热性、模板复杂度、目的片段的长度等。

退火

退火温度取决于引物的Tm值，通常为50～60 ℃（Tm ± 5 ℃），退火时间一般为10 s - 1 min。

适当提高退火温度，可以相对减少非特异性扩增，但会降低产量；适当降低退火温度，可以提高产量，但会降低特异性，根据实验的具体情况可以进行相应的调整。

延伸

一般延伸温度范围在68-78 ℃之间，通常设置为72℃，取决于聚合酶活性，延伸时间取决于目的片段长度及聚合酶的延伸速度。

循环数

通常为25-40，取决于DNA起始量、DNA聚合酶的扩增效率和目的片段的得率等。DNA起始量低，建议适当增加循环次数。循环数过多会增加PCR结果的碱基错误率。