一鸣惊人：反转录子基因编辑，超越CRISPR，谱写基因编辑新篇章
撰文 | 王聪
编辑 | nagashi
排版 | 水成文
细菌与噬菌体之间的军备竞赛导致细菌发展出了精妙的防御系统，近年来生命科学领域最大的突破——CRISPR基因编辑技术，正是从细菌的防御系统发展而来。
实际上，细菌除了CRISPR之外，还有其他防御系统，2020年11月5日，以色列维茨曼研究所的Rotem Sorek团队在Cell发表论文证实一种名为反转录子（Retron）的细菌的遗传元件同样也是细菌抵抗噬菌体的防御系统。
那么，反转录子（Retron）能否像CRISPR一样，被开发成强大的基因编辑工具呢？
2021年4月27日，哈佛医学院乔治·丘奇（George Church）团队在 PNAS 期刊发表了题为：High-throughput functional variant screens via in vivo production of single-stranded DNA 的研究论文。
乔治·丘奇团队创建了一个基于反转录子（Retron）的基因组编辑新工具，并将其命名为Retron Library Recombineering（RLR）。
该新型基因组编辑工具更简单、更灵活，可同时产生数百万个突变，通过给这些突变细胞打上“条形码”，可用于进行高通量功能筛选，可超过CRISPR-Cas技术支持的功能筛选的规模和特异性，而且避免了CRISPR基因编辑时经常观察到的毒性，并提高了研究人员探索基因组水平突变的能力。
反转录子的发现
上世纪80年代，研究土壤细菌的研究人员困惑地发现，许多单链DNA短序列散布在细菌的细胞质中。1984年，约州立大学石溪分校的Thomas Yee等人最早在Cell论文中提到了这一发现。
紧接着，研究人员发现每一个DNA片段都会与带有互补碱基序列的RNA相连，这使得他们意识到一种叫做逆转录酶的酶从附着的RNA中合成了DNA，并由此形成了一个由RNA、DNA和酶组成的复合体。随后科学家们发现这一复合体即是反转录子（Retron）。
直到36多年后的2020年，以色列维茨曼研究所的Rotem Sorek团队在Cell发表论文，首次解析了反转录子（Retron）的功能，证实其是细菌抵抗噬菌体的防御系统。详情：Cell论文揭示细菌的另一种防御系统，具有基因编辑潜力
反转录子的基因编辑潜力
反转录子（Retron）会通过逆转录产生单链多拷贝卫星DNA（msDNA），有研究表明，msDNA可以充当重组供体，在基因组中进行基因编辑。这种编辑方式与CRISPR不同，不需要额外的向导（guide）。反转录子的另一个吸引人之处在于它们的序列本身可以用作“条形码”，以识别细菌池中的哪些个体已接收到反转录子序列，从而可以更快地汇总筛选精确创建的突变菌株。
当研究人员了解到反转录子跟CRISPR系统类似，是细菌中的一种防御系统后，基于反转录子的基因组编辑开始吸引越来越多的目光。
到目前为止，基于反转录子的基因组编辑系统效率还很低，且不能在在哺乳动物细胞中发挥作用。尽管如此，反转录子在基因组编辑应用中仍显示出独特的优势。
反转录子重组
如下图所示，将含有目的突变（黑色）的反转录子序列（红色）与逆转录酶（RT）一起导入细胞，然后反转录子产生单链DNA，借助于单链退火蛋白（SSAP），携带目的突变的单链DNA被整合进复制产生的子代细胞的基因组中。
反转录子重组原理图
为了提高效率，研究团队对细菌进行了修改，首先，使细菌细胞的天然错配修复机制失活，然后敲除了两个编码外切核酸酶的基因，这些修改极大地增加了反转录子整合到基因组中的比例，效率高达90%以上。
然后，研究团队使用基于反转录子（Retron）的Retron Library Recombineering（RLR）对大肠杆菌进行了验证，证实RLR具有足够的灵敏性和精确度，能够检测到大肠杆菌由非常相似的突变导致的耐药性的微小差异。
更重要的是，通过对整个细菌库中的反转录子进行测序，而不需要对单个突变体进行分离和测序，就能够收集这些数据，可以极大地加快研究过程。
然后，研究团队继续推进RLR向前迈进，以查看它是否可以用于随机片段化的DNA，并找到一次可以使用多少个录子。研究团队“切碎”了一种具有高度耐药性的大肠杆菌菌株的基因组，通过反转录子质粒文库，能够一次性快速生产和筛选数百万个可追踪的DNA突变，相当于同时进行几百万次实验，能够观察到整个基因组突变的影响，以及这些突变之间如何相互作用。
跨越CRISPR
使用CRISPR-Cas9基因编辑，可以发现和切割特定的DNA片段，然后利用细胞的系我修复，实现对基因的精确编辑，但这一过程比较复杂，而且Cas9还可能出现脱靶，导致细胞毒性。
重组技术同样可以实现基因编辑，将含有所需突变的单链DNA和单链退火蛋白（SSAP）导入正在分裂复制的细胞内，就可以将突变引入子代细胞中，可以在不破坏细胞DNA的情况下有效产生基因突变，这种基于重组的方法更简单，可以在许多细胞中使用以创建复杂的突变库。但是，要弄清楚这些突变的作用是什么，就需要对每个突变体进行分离、测序和表征，这是一项几乎不可能完成的工作。
而现在，乔治·丘奇（George Church）团队开发的这个名为 RLR 的新型基因编辑工具，使上述不可能完成的任务变得更加容易。
RLR使我们能够进行CRISPR不可能完成的工作，构建远超CRISPR的筛选文库，并使用它们同时筛选数百万个序列，从而轻松生成和分析大量数据。
总的来说，RLR是一种更简单，更灵活的基因编辑工具，可用于高度多重实验，消除了CRISPR基因编辑时经常观察到的毒性，并提高了研究人员探索基因组水平突变的能力。
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