【LorMe周刊】细菌的噬菌体抗性与其耐药性权衡的多态性
作者：陆春霞，南京农业大学硕士在读。主要研究青枯菌与噬菌体的共进化。
细菌在环境中会遭遇噬菌体感染和抗生素胁迫，然而关于细菌的噬菌体抗性和抗生素耐药性之间的权衡仍不清楚。以往的研究表明，噬菌体抗性和抗生素耐药性之间存在正的或负的相互作用，这是因为噬菌体在侵染细菌过程中，可能高度依赖于细胞膜蛋白或其他表面结构，如外膜蛋白(OMPs)和脂多糖(LPSs)。而在某些情况下，这些结构也与细菌的抗生素耐药性密切相关。因此这些结构基因的突变可以使细菌获得噬菌体抗性的同时，影响其对抗生素的耐受性。这种因一个功能的选择突变而引起另一个功能的不同改变被称为多效性，一般发生在单个基因影响多个性状时。如果能够对这种多效性进行更详细的解释，可能会获得恢复耐药细菌对药物敏感性的方法。大肠杆菌噬菌体U136B和细菌外膜之间的相互作用可依赖于参与不同抗生素耐药性机制的两种宿主因子:外排泵蛋白TolC和结构屏障分子脂多糖(LPS)。本文研究了这些相互作用对噬菌体抗性进化及其对抗生素耐药性的多效性的影响，通过比较自发出现的以及在细菌-噬菌体进化过程中出现的噬菌体抗性突变和表型，发现脂多糖突变体对四环素的耐药性存在多效性，同时对噬菌体选择下的群体抗生素敏感性的变异进行了描述，表明多效性使得在描述噬菌体抗性和抗生素耐药性的权衡变得复杂。
筛选依赖于抗生素耐药性基因TolC和LPS感染大肠杆菌的噬菌体
首先鉴定利用抗生素外排泵蛋白TolC进行感染的噬菌体，筛选获得了噬菌体U136B，它在tolC敲除后不能形成噬菌斑，且来自质粒载体的tolC的表达完全恢复tolC敲除时的噬菌体U136B侵染力，同时敲除其他噬菌体使用的OMPs对其感染没有影响(图1A和B)。噬菌体U136B对液体培养中tolC敲除细菌的生长也没有影响(图1C)，且噬菌体不能在tolC敲除的细菌菌株上生长(图1D)。
图1 噬菌体U136B的EOP受体筛选显示TolC为候选OMP受体(A)，与野生型细菌一样，在敲除物中产生相同数量噬菌斑的噬菌体的EOP为1.0(虚线)，虚线下方的"bd”表示EOP低于检测极限(〜10-7)；与含有tolC的质粒的遗传互补，对tolC敲除的噬菌体U136B噬菌斑形成能力的变化(B)；野生型和tolC突变型细菌在有无噬菌体下的细菌生长曲线(C)；噬菌体U136B在野生型和tolC突变型细菌的单步生长曲线(D)
除OMP受体外，许多噬菌体在与宿主细胞最初接触时还需要LPS受体。为了鉴定该噬菌体是否依赖LPS，对涉及LPS合成的一组rfa基因进行了筛选，通过基因敲除测试其能否侵染，发现噬菌体U136B需要其中4个rfa基因(图2A)。同时基于遗传互补测试证实了这些基因是噬菌斑形成所必需的(图2B)。这四个基因(rfaC，rfaD，rfaE和rfaP)都参与了LPS多糖成分核心区域的形成(图2C)，由此表明噬菌体U136B侵染需要LPS的内核。
图2 LPS合成基因敲除的噬菌体U136B的EOP筛选对噬菌体复制重要基因的揭示(A)，虚线下方的" bd"表示EOP低于检测极限(〜10-7)；与含有各自rfa基因的质粒进行遗传互补，对该噬菌体突变体噬菌斑形成能力的测定(B)；参与LPS合成的基因示意图(C)
脂多糖突变体对四环素抗性有多效性
为了确定噬菌体抗性突变体是否影响了细菌对抗生素的抗性，分析它们与野生型亲本菌株(噬菌体敏感菌株)对四环素(由tolC变化介导)和粘菌素(由LPS相关变化介导)的最低抑制浓度(MIC)的差异。结果显示，与亲本菌株相比，所有六个tolC突变体对四环素的抗性均降低，并且与tolC敲除对照的表型相似(图3A)；一些tolC突变体对粘菌素的抗性降低(图3B)。与亲本菌株相比，具有LPS相关的噬菌体抗性突变体对粘菌素的抗性降低(图3B)。值得注意的是，一小部分LPS突变体对四环素的抗性增加(图3A)，但它们对粘菌素的抗性降低。该结果表明，突变的LPS对四环素抗性具有多效性作用(图3C)。
图3 噬菌体抗性和抗生素耐药性之间的权衡：来自波动实验的抗噬菌体分离株的MICs(A、B)；从噬菌体处理群落中进化的抗噬菌体分离株的MICs(D、E)；在噬菌体对照种群中进化的噬菌体敏感分离株的MICs(G、H)
噬菌体选择下群体抗生素敏感性的演变
前期的波动实验揭示了大肠杆菌群体在噬菌体存在情况下可能出现tolC和LPS相关基因的突变体。在本研究中，通过进行10天传代培养试验，进一步探究长期互作的细菌和噬菌体群落中是否会选择这些相同类型的突变。每天实时计算总细菌密度(图4A)和四环素抗性细菌密度(图4B)。这些结果表明，与拮抗多效性相一致，与噬菌体U136B共进化的细菌群体中有四环素抗性的表型频率（相对于总种群）较低。在第5天噬菌体灭绝之前和第10天实验结束时都存在这种效应(图4B)，但噬菌体处理对细菌总密度没有显著影响(图4A）。
为研究进化种群的适应性和多效性模式的遗传基础，在第10天从每个种群对照(-噬菌体)和处理(+噬菌体)种群中随机分离出一个细菌菌落。经过10天的进化，从处理种群中分离出的菌落以tolC突变株为主，没有LPS相关的突变株。然而，这些进化的tolC突变体中的3/10也保留了原始四环素抗性表型(图3D)，表明这些噬菌体抗性突变对四环素抗性没有多效性作用。为了追踪抗四环素的种群成员，从接种于含四环素的琼脂上的培养物中获得了分离株，结果发现tolC突变在所有处理种群中并不稳定。尤其是进化10天后，处理种群中的随机分离株均未增加四环素抗性。四环素抗性的动态在噬菌体灭绝前后有所不同，这表明群体间的差异部分是由群体内宿主突变之间的竞争动态驱动的。
图4 在选择噬菌体抗性时，细菌种群中抗生素敏感性的变异：在存在和不存在噬菌体的情况下，总细菌种群密度(A)和对四环素具有抗性的细菌密度(B)
本文针对噬菌体、抗生素抗性和抗生素敏感细菌之间的相互作用进行研究，筛选鉴定了依赖于抗生素耐药性基因tolC和LPS感染的噬菌体U136B。同时使用波动分析发现，噬菌体U136B在编码其关键宿主进入因子tolC和LPS的基因中选择宿主突变。这些抗噬菌体突变对四环素、粘菌素或两者的敏感性具有多效性变化，包括拮抗多效性和协同多效性。噬菌体抗性突变体及其相关的抗生素敏感性表型也在大肠杆菌和噬菌体U136B的群落中进化。噬菌体U136B和其他类似的噬菌体可能有助于直接治疗病原菌感染，但仍需要更多的研究来理解复杂环境中噬菌体宿主范围基因、噬菌体抗性、抗生素耐药性和其他性状之间多效性相互作用的复杂性。
论文信息
原名：Pleiotropy complicates a trade-off between phage resistance and antibiotic resistance
译名：多效性复杂化噬菌体抗性和抗生素耐药性之间的权衡
期刊：PNAS
IF2020：9.412
发表时间：2020.03
通讯作者：Alita R. Burmeister or Paul E. Turner
通讯作者单位：耶鲁大学