如何运用荧光蛋白 ？
根据FP与目标蛋白连接与否，可将实验分为两类：非融合表达与融合表达。
非融合表达：常用于追踪目的基因表达水平（图3），需要着重考虑FP亮度、光稳定性、环境敏感度等要素。
图3. 荧光蛋白非融合表达示意图
例如，有研究者利用Myh6基因启动子构建了心肌细胞特异性表达Cas9的转基因小鼠，并在Cas9后加上2A-GFP或2A-TdTomato的荧光蛋白元件（图4A），以使其作为报告基因来监测Cas9的表达，结果发现Myh6-Cas9-2A-GFP（图4B）和Myh6-Cas9-2A-TdTomato（图4C）小鼠的心肌细胞中均特异性高表达了Cas9蛋白。
图4. Myh6-Cas9转基因小鼠品系构建。(A) Myh6-Cas9-2A-GFP和Myh6-Cas9-2A-TdTomato转基因小鼠构建策略。(B)荧光显微镜证实GFP在Myh6-Cas9-2A-GFP转基因小鼠的心脏中高表达，同窝阴性对照（左）。(C)荧光显微镜证实TdTomato在Myh6-Cas9-2A-TdTomato转基因小鼠的心脏中高表达，同窝阴性对照（左）。(D) Western blot证实在Myh6-Cas9-2A-GFP和Myh6-Cas9-2A-TdTomato小鼠中均有带有Flag标签的Cas9蛋白表达。
融合表达：常用于目标蛋白的亚细胞定位、迁移示踪或蛋白互作探究（图5）。融合表达中，选择FP需要考虑的因素更为复杂，不合适的FP可能会影响融合目标蛋白的定位和功能，因此FP的选择将视具体情况而定。
那么，有没有通用的设计思路呢？下面，让小编带大家整理一套简便的荧光融合蛋白（Fluorescent fusion protein, FFP）设计方案。
图5. 荧光蛋白融合表达示意图（以3’ 端融合为例）
Step 1 选择目的蛋白与荧光蛋白的融合方式。依据目标蛋白的功能与定位信号是否已知，可以分别实施以下两个策略：
策略一（适用于目的蛋白的功能域和靶向域未知）：
为构建出功能完善且针对性强的FFP，我们应设计两种结构，分别将FP放在目标蛋白的N端和C端。这是因为有些目的蛋白的折叠包括其N端或C端，若我们把FP放在目的蛋白折叠端，将观察不到荧光信号。
此外，有些目的蛋白在翻译后修饰过程中存在一端被剪切现象，如果荧光蛋白处于被剪切的一端，那么就不能获得目的蛋白准确的定位信息。
因此对于已知信息有限的新蛋白，建议构建N端和C端两种融合方式的细胞或小鼠以便后续确定最优解。
策略二（适用于目的蛋白的功能域和靶向域已知）：
根据已知信息，将FP插入最佳位置（即FP不干扰靶向结构域或蛋白质折叠的位置）。
以内质网蛋白（ERs）为例，ER蛋白通常包含两个具有靶向信息的关键序列：N端的信号肽和C端的ER驻留信号序列。其中，信号肽对于新生肽靶向到内质网腔中至关重要。因此，FP必须放置在信号序列之后，但是具体应放在哪呢？
如果蛋白功能域位于C末端附近，则将FP置于信号序列之后比较合理（图6A）。具体来说，应将FP置于预测的信号序列切割位点的下游2至10个氨基酸，以提高信号肽切割效率与FFP向ER转运的效率。
如果蛋白功能域靠近N端，则应将FP置于C端附近（图6B）。具体来说，ER驻留信号序列是KDEL，可将FP置于KDEL序列前。
图6 荧光融合蛋白(FFP)构建示例。目标蛋白序列中FP融合的优选位点用笑脸表示。（A）ER蛋白包含N端信号肽（SP），靠近C端的功能域（FD）和C端驻留信号序列（KDEL）。将FP插入在SP之后，可最大程度减少干扰目的蛋白的功能。（B）ER蛋白包含N端信号肽（SP），靠近N端的功能域（FD）和C端驻留信号序列（KDEL）。将FP插入在KDEL之前，可最大程度减少干扰目的蛋白的功能。
Step 2选择适合的FP进行融合表达。我们需要重点考虑FP形成低聚物的概率（齐聚度），实际分子大小和蛋白质电荷（大型或带电的FP融合物可能会改变目标蛋白的折叠与亚细胞定位）等。
例如，有研究人员将非单体型的EGFP与ER膜蛋白融合表达后发现EGFP的存在导致滑面ER形成了组织状结构，而单体型EGFP（mGFP）则没有影响ER结构（图7A,B）；而将mRFP与膜蛋白融合表达时，在细胞中观察到了鲜红色的聚点状信号，这是由于mRFP与膜蛋白的融合减少了该蛋白的旋转扩散趋势，从而形成了聚集体（图7C）。
图7 荧光蛋白与天然蛋白的融合可能会改变天然蛋白的正常定位模式，或导致聚集体的形成。（A）非单体化EGFP与内质网（ER）膜蛋白的融合诱导了滑面ER组织状结构的形成。（B）单体化EGFP（mGFP）与相同蛋白质的融合则不会显著改变ER结构。（C）Cos-7细胞表达两种荧光融合蛋白（FFP），mGFP和mRFP均定位到内质网。但由mRFP标记的蛋白产生的图像显现许多亮点信号，为mRFP聚集体。
Step 3 评估FFP的表达情况。在构建FFP后，我们必须评估表达的FFP是否发荧光，是否以类似于细胞内天然蛋白的模式定位（例如，通过将目的蛋白免疫荧光分布和荧光融合蛋白的荧光分布进行对照），是否保留了天然蛋白质的功能（由研究者自己的测定方法确定）。