纯生信10分 ，m6A甲基化修饰与肿瘤微环境
m 6 A regulator-mediated methylation modification patterns and tumor microenvironment infiltration characterization in gastric cancer
m 6 A调节剂介导的甲基化修饰模式和胃癌的肿瘤微环境浸润特征
发表期刊：Mol Cancer
发表日期：2020 Mar 12
影响因子：15.302
DOI: 10.1186/s12943-020-01170-0
在所有活生物体中，作为表观遗传学的第三层，已鉴定出150多种RNA修饰，包括5-甲基胞嘧啶（m 5 C），N6-甲基腺苷（m 6 A）和N1-甲基腺苷（m 1 A）。在这些修饰中，广泛存在于mRNA，lncRNA和miRNA中的m 6 A RNA甲基化被认为是真核细胞内部修饰的最突出和最丰富的形式。越来越多的证据表明，m6A调节剂的表达失调和基因变化与多种生物过程的紊乱相关，包括细胞死亡和增殖失调、发育缺陷、肿瘤恶性进展、自我更新能力受损、免疫调节异常等。
近来，一些研究揭示了TME浸润免疫细胞与m6A修饰之间的特殊相关性，这不能通过RNA降解机制来解释。但由于技术的限制，上述研究必然只局限于一两个m6A调节因子和细胞类型，而抗肿瘤作用的特点是众多肿瘤抑制因子高度协调地相互作用。因此，全面认识多个m6A调节因子介导的TME细胞浸润特征，将有助于提高我们对TME免疫调节的认识。
1）从TCGA中获取TCGA-STAD队列，使用R包TCGAbiolinks将FPKM值转换为TPM值。
2）GEO数据库中获取GSE15459，GSE34942，GSE57303，GSE62254 （ACRG），GSE84437，GSE26253数据的CEL文件。采用了强大的多阵列平均方法以及affy和simpleaffy软件包来执行背景调整和分位数归一化。
3）从TCGA数据库获得体细胞突变数据。
4）ACRG队列的GSE62717数据集进行拷贝数变异（CNV）分析。
流程图
01 - 胃癌m 6 A调控因子遗传变异景观
在433个样本中，有101个样本发生了m6A调节剂的突变，频率为23.33%。ZC3H13表现出最高的突变频率，其次是KIAA1429（图1B）。21个调控因子普遍存在CNV改变，且大多集中在拷贝数的扩增上（图1C）。m6A调节子的CNV改变在染色体上的位置如图1D所示。根据这21个m6A调节子的表达情况，我们完全可以将GC样本与正常样本区分开来（图1E）。与正常胃组织相比，CNV扩增的m6A调控因子在GC组织中的表达量明显较高，反之亦然（图1C和F）。
图1 胃癌中m 6 A调节子的遗传和表达变异情况
02 - 不同m 6 A修饰模式下的TME细胞浸润特性
将5个具有可用OS数据和临床信息的GEO数据集（GSE15459、GSE34942、GSE57303、GSE62254（ACRG）和GSE84437）纳入一个metacohort。单变量Cox回归模型揭示了21个m6A调节剂在胃癌患者中的预后价值。用m6A调节器网络描绘了GC患者m6A调节器相互作用、调节器连接及其预后意义的综合景观（图2A）。
作者发现，writers基因表达量高的肿瘤是否表现出低的erasers基因表达量，实际上取决于不同的writers和erasers基因（图S2A-S2H）。考虑到writers基因ZC3H13的突变频率相对较高，我们分析了ZC3H13-突变体与野生型之间erasers基因的表达差异。其中，与野生型肿瘤相比，ALKBH5在ZC3H13-突变体肿瘤中显著上调，而FTO则显著下调（图S2I）。
图S2 writers基因表达/突变与橡皮擦基因表达之间的相关性
根据21个m6A调节器的表达情况，利用无监督聚类确定了三种不同的修饰模式，其中模式A为389例，模式B为348例，模式C为322例，将这些模式分别称为m6Acluster A-C（图S2J）。三种主要m6A修饰亚型的预后分析显示，m6Acluster-B修饰模式的生存优势尤为突出（图2B）。
为了探索这些不同的m6A修饰模式之间的生物学行为，作者进行了GSVA富集分析。如图2C所示，m6Acluster-A明显富集于基质和致癌激活途径。m6Acluster-B呈现出与免疫完全激活相关的富集途径。而m6Acluster-C则突出地与免疫抑制生物过程有关（图2D）。
随后对TME细胞浸润的分析表明，m6Acluster-A在先天性免疫细胞浸润中非常丰富，包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、MDSC、浆细胞树突状细胞等（图3A）。然而，具有这种m6A修饰模式的患者并没有表现出匹配的生存优势（图2B）。
根据GSVA分析结果，作者发现三种m6A修饰模式具有明显不同的TME细胞浸润特征。A群被划分为免疫排除型，以先天性免疫细胞浸润和基质激活为特征；B群被划分为免疫炎症型，以适应性免疫细胞浸润和免疫激活为特征；C群被划分为免疫荒漠型，以抑制免疫为特征（图2C-D和3A-B）。
利用CIBERSORT方法，比较三种m6A修饰模式中免疫细胞的成分差异，发现三种m6A修饰模式对TME细胞类型的组成没有显著差异，这说明m6A甲基化修饰并没有改变肿瘤的TME浸润-细胞类型（图S2K）。
图2 m6A甲基化修饰的模式及每种模式的生物学特征
使用spearman相关分析检查了每个TME浸润细胞类型和每个m6A调节器之间的具体相关性。作者重点研究了m6A甲基转移酶的调节因子KIAA1429。发现KIAA1429介导的m6A甲基化修饰可能促进TME DCs的活化，从而增强瘤内抗肿瘤免疫反应。
03 - ACRG队列中的m 6 A甲基化修饰模式
为了进一步探索这些m6A修饰表型在不同临床性状和生物学行为中的特点，作者将注意力固定在ACRG队列上（n=300）。无监督聚类发现了ACRG队列中三种完全不同的m6A修饰模式，三种不同的m6A修饰模式在m6A转录谱上存在显著的区别（图3C-D）。大部分EMT亚型的患者都聚集在m6Acluster A中，几乎没有EMT亚型在m6Acluster B中，这再次证实了m6Acluster A与基质激活显著相关，m6Aclustre B与免疫激活相关（图3E）。单因素方差分析检验也证实了三种关键m6A修饰模式对m6A调节器表达的显著差异。
图3 在不同的m6A修饰模式下的TME细胞浸润特征和转录组特征
04 - m 6 A基因标志的生成和功能注释
为了进一步研究每个m6A修饰模式的潜在生物学行为，作者使用limma包确定了718个m6A表型相关的DEGs。使用clusterProfiler包对DEGs进行GO富集分析。这些基因的生物过程与m6A修饰和免疫力有明显的富集，这再次证实了m6A修饰在肿瘤微环境的免疫调控中起着不可忽视的作用（图3F）。
接下来根据得到的718个m6A表型相关基因进行了无监督聚类分析，无监督聚类算法也揭示了三种不同的m6A修饰基因组表型，我们将这三个聚类分别命名为m6A基因簇A-C（图4A）。三个不同的基因簇具有不同的特征基因。三百名胃癌患者中，有八十八名患者聚集在基因簇A中，这被证明与较好的预后有关。而基因簇C的患者（105例）经历了预后较差的结果。在基因簇B中观察到了中等预后，有107名患者聚在一起（图4B）。在三个m6A基因簇中，观察到m6A调节因子表达的突出差异，这与m6A甲基化修饰模式的预期结果一致（图4C）。
图4 构建m6A签名
考虑到m6A修饰的个体异质性和复杂性，基于这些表型相关基因，作者构建了一套评分系统，对胃癌患者个体的m6A修饰模式进行量化，称之为m6Ascore。采用桑基图将个体患者的属性变化进行可视化描述（图4D）。还测试了已知签名与m6Ascore之间的相关性（图4E）。基因簇A的中位数得分最低，而基因簇C的中位数得分最高（图4F）。更重要的是，m6A簇A的m6Ascore比其他簇显著增加，而m6A簇B的中位数最低（图4G）。对基质相关通路活性的分析表明，高分与基质通路的激活增强显著相关（图4H）。此外，与其他三种ACRG分子亚型相比，EMT亚型患者的m6Ascore也是最低的（图5A）。上述结果提示，低m6Ascore与免疫激活显著相关，高m6Ascore与基质激活相关。
05 - m 6 A相关表型的临床和转录组性状的特点
为了揭示m6A相关表型在TME免疫调节中的作用，作者研究了3个基因簇的趋化因子和细胞因子的表达特征。
结果发现基因簇C中与TGFb/EMT通路相关的mRNA明显上调，证明该簇被认为是基质激活组。而基因簇A中免疫激活转录相关mRNA的表达量较高（图S5F-S5H）。为了更好地描绘m6A特征基因的功能，我们考察了胃癌患者的已知特征基因（图S5E）。结果也证实，基因簇C以基质激活和促癌状态为特征，基因簇A与免疫激活状态显著相关（图S5E-S5H）。
图S5 细胞因子转录组、趋化因子转录组及不同基因簇中已知标志的特点
接下来，进一步确定m6Ascore在预测患者结局方面的价值。以survminer软件包确定的截止值0.0291，将患者分为低或高m6Ascore组。低m6Ascore患者表现出突出的生存获益（图5B）。多变量Cox回归模型分析，包括患者的年龄、性别、TNM状态、组织学类型、MSI状态、TP53状态和ACRG分子亚型等因素，证实m6Ascore是评价患者结果的稳健和独立的预后生物标志物。作者特别研究了m6Ascore特征预测胃癌患者辅助化疗疗效的能力，发现低m6Ascore的患者在同时接受辅助化疗的患者中表现出明显的治疗优势（图5C）。
图5 TCGA分子亚型中m6A修饰的特点及肿瘤体质突变
06 - TCGA分子亚型中m 6 A修饰的特点及肿瘤体质突变的特点。
TCGA项目构建了一个全面的胃癌分子景观，将胃癌分为4个分子亚型，包括基因组稳定（GS）、微卫星不稳定（MSI）、EBV感染和染色体不稳定（CIN）。较高的m6Ascore明显集中在GS亚型上，患者的生存率较差，而较低的m6Ascore集中在MSI和EBV感染的亚型上，与较好的生存率有关（图5D-E）。高度微卫星不稳定亚型的特点是预后较好，与较低的m6Ascore显著相关，而MSI-Low和MSS的m6Ascore较高（图5F）。在胃癌患者中，m6Ascore特征可能是比MSI和TMB更有效的预测免疫治疗疗效的生物标志物（图5E-F）。
作者利用maftools软件包分析了TCGA-STAD队列中m6Ascore低和高的体细胞突变的分布差异。如图5G-H所示，低m6Ascore组比高m6Ascore组呈现出更广泛的肿瘤突变负担。
TMB定量分析证实低m6Ascore肿瘤与高TMB明显相关，m6Ascore和TMB也表现出明显的负相关。对于TCGA-TSAD中的特定改变基因，突变型与野生型相比，m6Ascore显著降低（图5F）。
07 - m 6 A修饰模式在抗PD-1/L1免疫治疗中的作用
作者基于两个免疫治疗队列，研究m6A修饰特征是否可以预测患者对免疫检查点阻断治疗的反应。在抗PD-L1队列(IMvigor210)和抗PD-1队列(GSE78220)中，m6Ascore较低的患者均表现出显著的临床获益，生存期明显延长(图6A-G)。证实了低m6Ascore患者与高m6Ascore患者相比，抗PD-1/L1免疫治疗具有显著的治疗优势和临床反应。
此外，低m6Ascore的患者PD-L1的表达量明显偏高，这表明其对抗PD-1/L1免疫治疗有潜在的反应（图6H）。高m6Ascore的肿瘤中调节性T细胞和TME基质被明显激活，介导了肿瘤的免疫耐受（图6I）。低m6Ascore和高新抗原负担相结合的患者具有很大的生存优势（图6J）。上述情况意味着m6A修饰模式的量化是一个潜在的、稳健的生物标志物，可用于免疫治疗的预后和临床反应评估（图6K）。较高的m6Ascore与排异和沙漠免疫表型显著相关，检查点抑制剂难以在这些表型中发挥抗肿瘤作用（图6L)。
综上所述，本研究有力地表明，m6A甲基化修饰模式与肿瘤免疫表型和抗PD-1/L1免疫治疗的反应显著相关，建立的m6A修饰特征将有助于预测抗PD-1/L1免疫治疗的反应。
图6 m6A修饰模式在抗PD-1/L1免疫治疗中的作用
本研究基于21个 m 6 A调节剂，揭示了三个不同的m 6 A甲基化修饰模式，这三种模式具有明显不同的TME细胞浸润特性。此外，已证明不同的m 6 A修饰模式之间的mRNA转录组差异与m 6 A和免疫相关的生物途径显着相关。这些差异表达的基因被认为是m 6 A相关的特征基因。考虑到m 6 A修饰的个体异质性，作者建立了一套评分系统来评估单个胃癌患者的m 6 A修饰模式-m 6 A基因标记，在精确免疫疗法治疗胃癌中显示出可预测的优势。
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