“反直觉”的蛋白质结构？揭秘不为人知的蛋白质交联 |《自然》封面故事
原文作者：Deborah Fass & Sergey N. Semenov
包含二硫键（disulfide）在内的分子交联（molecular crosslink）能够稳定蛋白质的三维结构，调节蛋白质的功能。除二硫键外，科学家又发现了另一种有调节作用的蛋白质交联。
氨基酸的排列顺序决定了蛋白质特有的结构和功能。组成蛋白质的氨基酸通常带有化学修饰，特定氨基酸残基间的交联（crosslink）就是其中之一。二硫键是最为常见的交联，其中两个硫原子以共价键相连。Wensien等人[1]在《自然》上报道了一种全然不同的蛋白质交联：由氧原子分别连接一个氮原子和一个硫原子。作者进一步指出，此种N-O-S桥在先前报道的其他蛋白质结构中并未受到关注。
淋球菌（neisseria gonorrhoeae）是性传播疾病的致病菌之一。Wensien与同事在研究该菌的转醛醇酶（tranaldolase）时发现，经纯化的酶几乎完全丧失活性，而常用于切断二硫键的还原剂却能使酶活性复原。
形成二硫键需要两个空间上相邻的半胱氨酸（cysteine）侧链，尽管它们可能在一级结构中相距很远。由于转醛醇酶中有数个半胱氨酸残基，作者推断其中两个形成二硫键而导致酶的失活。在将这些半胱氨酸逐一替换为其他氨基酸时，却发现仅有一种突变蛋白抵抗了失活。假如使酶失活的二硫键确有其事，那么替换任意一个组成二硫键的半胱氨酸都理应产生以上效应（尽管此简化结论也有例外[2]），这究竟是为什么呢？
Wensien 等人通过X射线晶体衍射（X-ray crystallography）获得转醛醇酶原子级分辨率结构，解决了这一谜题。结构揭示出一条连接半胱氨酸和赖氨酸（lysine）的N-O-S桥，而并非两个半胱氨酸间的二硫键（图1）。问题在于N-O-S桥中的氧原子的来源既非赖氨酸，也非半胱氨酸，因为二者的侧链分别包含一个氨基（NH2）和一个巯基（SH）。在不含交联的还原态蛋白的晶体结构中，作者却发现一个与这些侧链相邻的分子氧。据此，作者合理地猜测N-O-S桥中的氧原子源自于氧气分子。
图1 | 赖氨酸、半胱氨酸残基间的桥的形成。Wensien等[1]报道，淋球菌转醛醇酶中含有一条由氧原子桥接氮原子（赖氨酸侧链）与硫原子（半胱氨酸侧链）的分子交联。作者提出N-O-S桥是由氨基酸侧链与分子氧（O2）反应所得。通常情况下N-O-S模体并不稳定，其稳定性有可能源自于周围的蛋白质结构，而使用还原性试剂又可将其破坏。球形代表蛋白质的其他部分。
在蛋白质结构中发现N-O-S桥之所以重要，是因为能够生成这种模体的非生物学反应是未知的。一个可能的例外是一种特殊的环状芳香化合物[3]。对小分子来说，氮氧键的形成需要强氧化性条件[4]，但同时硫也有可能转变至更高的氧化态，无法形成N-O-S桥。此外，含有N-O-S结构的小分子化合物有发生歧化反应（disproportionation）的风险，即相同的两个分子彼此反应，生成两个不同产物。蛋白质中N-O-S桥的形成，或许是得益于半胱氨酸的巯基、赖氨酸的氨基与氧气分子分别处在利于氧化反应发生的位置上。而周边蛋白质结构所造成的空间位阻或能提高交联的稳定性，也避免硫被进一步氧化。
在几种可能的机理中，作者倾向于认为半胱氨酸的硫原子与赖氨酸的侧链氨基分别带有羟基（OH）基团（见[1]附图3b）。由于这种N-O-S桥十分新颖，而这项研究聚焦于结构生物学，关于其化学机理的重要细节仍需深入研究。具体而言，我们仍不清楚氧气分子是如何被活化而后参与反应的。既然许多分子氧的化学反应都有自由基（radical）参与[5]，那么考虑自由基反应作为形成N-O-S桥的机理便是顺理成章的了。
交联如何影响酶活性则是另一个需要解决的机理问题。由于交联对转醛醇酶催化部位的结构仅造成些微的改变，因此N-O-S桥抑制酶活性的原理并不显著。除细微的结构差异之外，作者还观察到交联使得酶在热诱导下更难展开。此结果并不令人意外，交联减少了酶在结构上的波动，因而更难展开。酶的催化活性（catalytic activity）有时需要更小范围的结构波动，而交联可能恰好限制了这种结构变化。
通过二硫键还是N-O-S桥调节酶的功能，二者在概念上有着重要的区别。二硫键的形成是可逆的。生物系统内，蛋白质中的二硫键不断地生成、断裂，是与其他生物分子内的二硫键或巯基进行“交换”的结果。相反，N-O-S桥的生成和断裂是两个不同的化学反应，生成时消耗一个分子氧，断裂时却没有氧放出。
此外，热力学表明形成N-O-S桥的反应较难，断裂却容易。因此推测在进化过程中，N-O-S桥被用于酶的选择性活化，同时保留分子内的二硫键。那么N-O-S桥的独特优势是什么？在何种场景下N-O-S桥比二硫键更有用？这些问题还有待探索。
发现新型蛋白质交联的意义不止于对酶和N-O-S桥的研究。出人意料的是，在高解析度X射线数据可用的情况下，蛋白质结构模型的确立有时反而会更加困难。低解析度下，蛋白质构象和化学组成的变化可能被数据的噪音所覆盖。而这些变化在高解析度下清晰可见，因而必须被解读[6]。高解析度的数据可能包含许多意想不到的化学结构，Wensien等人的研究将会启发结构生物学家探究生物分子电子密度图（electron-density map）中出现的“意料之外”。
长久以来，酶被认为是世界上最好的有机化学家。少了它们，许多反应几乎不可能发生。而Wensien等人的发现表明，构成酶自身的共价键也能够成为化学上的“反直觉”。
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