乙肝功能性治愈的替代评判指标，被质疑了！
慢性乙肝的患者定期会去医院检查“乙肝两对半”，盯着检验报告看乙肝表面抗原（HBsAg）有没有降低，甚至有没有消失。走进诊室和医生交流什么时候才能摘掉乙肝的“帽子”。
一般情况下，如果HBsAg消失，我们可以认为患者体内的HBV病毒被“清除”，往往可视为近似“治愈”。
不过，今天我们要介绍的这项研究成果，可能要打破大家对HBsAg的认知了。
近日，瑞士巴塞尔大学医院的Stefan Wieland和Markus H. Heim领衔的研究团队，在著名期刊Journal of Hepatology上发表重要研究成果[1]。
他们指出血液中HBsAg的消失，可能不是判断HBV感染缓解或“功能性治愈”的有效替代指标。
简单地说，这项研究对目前采用的“功能性治愈”的替代评判指标提出了“质疑”。如果这项研究成果被进一步证实，那么可能更多的慢性乙肝患者可以被定义为获得“功能性治愈”，实现“乙肝脱帽”。
CHB患者体内的HBsAg可能主要来源于整合HBV DNA
我国是一个乙肝大国。据估计，目前我国一般人群HBsAg流行率为5%~6%，慢性HBV感染者约7000万例，其中慢性乙肝患者约2000万~3000万[2]。常用的抗乙肝病毒治疗方案包括口服的核苷(酸)类似物（丙酚替诺福韦、恩替卡韦、替诺福韦二吡呋酯等）和皮下注射的长效干扰素。
众所周知，慢性乙肝患者其实是需要长期接受抗病毒治疗的，但在治疗过程中如出现了HBsAg消失，并且在停止药物治疗后，HBsAg还是保持阴性、HBV DNA检测不到、肝功能正常、肝脏组织病变得到改善的话，这就是前面提到的达到了乙肝“功能性治愈”。
实现“功能性治愈”不仅意味着肝病进展会延缓、停药后复发会减少、肝硬化和肝癌发生风险会降低，甚至全因死亡率也会降低[3]。
益处良多，因此追求“功能性治愈”一直是医患双方共同的目标。并且长期的临床实践中，无论是医生还是慢性乙肝患者，都认为只有在接受抗病毒治疗后血清中HBsAg没有了，才意味着HBV感染的消失，才算是乙肝的 “功能性治愈”。
如此重要的HBsAg，它从哪里来？这就不得不提到HBV感染的生命周期了。
HBV感染肝细胞后，会最终在肝细胞核内形成共价闭合环状（ccc）DNA，它是病毒复制和产生HBsAg的模板，是慢性乙肝持续感染的元凶。
不过，在HBV感染人体的过程中，还会出现这样一种情况：HBV 基因中一个片段或全基因片段，会与人体细胞中的基因整合在一起，常见的是HBV的S基因与肝细胞染色体DNA整合，这样整合的DNA也能制造出HBsAg。
也就是说，即使HBV被完全清除了，整合的DNA仍然有可能源源不断地产生HBsAg并释放到血液循环中。
HBeAg阴性慢性乙肝在慢性乙肝的自然史中处于较晚期的阶段，病人年龄往往较HBeAg阳性乙肝患者大，由于感染时间相对较长，出现HBV DNA整合的几率也较大。去年发表的一项研究表明，在HBeAg阴性的慢性乙肝患者中，有多达20%以上的肝细胞内存在整合的HBV DNA[4]。但是目前尚不清楚，由整合HBV DNA表达HBsAg是否会发生整个肝脏细胞中？
为了回答这个问题，Stefan Wieland和Markus H. Heim的团队对38例HBeAg阴性患者的血清病毒载量、肝组织中HBsAg免疫组化阳性比例等数据进行分析，其中24例是HBeAg阴性的慢性感染者(ENCI)，14例为HBeAg阴性的慢性乙肝患者(ENCHB)。此外还有1例高病毒载量的HBeAg阳性的慢性乙肝患者(编号A659)，1例乙肝病毒和HBsAg免疫组化均阴性的ENCI(编号C064)作为对照参考。
与既往的研究[5]类似，上述38例HBeAg阴性患者中，病毒载量与HBsAg阳性的肝细胞比例之间没有相关性(r = 0.248, p = 0.14)。事实上，一些ENCI尽管病毒载量很低，但却有超过90%的肝细胞呈现HBsAg阳性。作者因此推测，在这些患者中，HBsAg的产生可能与乙肝病毒的复制没有关系。
ENCI中，尽管病毒载量很低(右纵坐标)，但肝内HBsAg呈现非常高的阳性率(左纵坐标)
推测终究是推测，必须用证据说话。为此，研究者们选取了上述4例病毒载量≤2000IU/mL但90%以上肝细胞内HBsAg免疫组化阳性的ENCI(编号C812、C299、C912、C497)，以及2例对照患者(编号A659、C064)，分析肝细胞内cccDNA和整合DNA在转录和翻译层面的表达情况。
首先，我们来看看转录水平的产物——RNA的表达情况。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对肝脏中总HBV RNA，以及cccDNA转录的乙肝前基因组(pg)RNA进行定量检测。尽管这些ENCI病毒载量很低，但在肝脏组织中却检测出大量的总HBV RNA，平均53-109拷贝/细胞，而且pgRNA的含量不足2.5%。因此，这就验证了大部分的HBV RNA是由整合的HBV DNA而非cccDNA转录而来。
ENCI患者肝内HBV mRNA高表达
并且，在同一患者中的原位杂交技术(ISH)分析也显示，肝细胞中HBV RNA的高表达与HBsAg的高表达是基本一致的。
肝活检组织中广泛存在HBsAg和HBV RNA：(A)采用HBsAg特异性免疫组化(HBsAg IHC)和HBV RNA原位杂交(HBV RNA ISH)方法定量检测；(B) HBV RNA阳性肝细胞的比例与HBsAg阳性细胞的比例相近
其次，为了进一步验证肝细胞内大量表达HBsAg的模板来源，研究者用RT-qPCR对肝内cccDNA和总HBV DNA进行定量检测。
结果显示，肝细胞中普遍存在HBV RNA和HBsAg的ENCI样本中，每个肝细胞中总HBV DNA约2-4个拷贝数，但cccDNA仅为0.03-0.29个拷贝数。
这些结果进一步表明，整合的HBV DNA才是ENCI肝脏中大多数HBV mRNA转录和HBsAg翻译的真正模板。
采用qPCR方法检测肝细胞内总HBV DNA和cccDNA含量
但是，上述的研究仅在4例病毒载量≤2000IU/mL的ENCI中进行了检测和分析，那么包括ENCHB在内的其他HBeAg阴性的患者中，HBV DNA的整合是不是仍然普遍存在呢？
为此，研究者们采用上述同样的方法，对剩余34例患者肝组织中的总HBV DNA和cccDNA进行检测和分析。与之前4例患者一样，肝脏细胞质HBV DNA和cccDNA水平较低，分别为每个细胞约0.007和0.01个拷贝数，而相比之下，细胞核内HBV DNA水平为每个细胞0.91个拷贝数。
细胞核内HBV DNA水平分别比细胞质HBV DNA和cccDNA高122倍和92倍，这就表明大多数患者的肝细胞核内的染色体整合了HBV的片段。由此可见，HBeAg阴性患者肝细胞内广泛存在HBV DNA整合，并且发挥模板作用产生出大量HBsAg。
HBeAg阴性患者肝细胞核内存在丰富的HBV DNA
研究者的层层抽丝剥茧，验证了HBeAg阴性的患者中，整合的HBV DNA是大部分HBsAg表达来源的假说。并且，在HBeAg阴性的患者中，普遍存在HBV DNA的整合，源源不断地产生HBsAg释放到血液循环中。
因此，对于HBeAg阴性的慢性乙肝患者，即使HBV病毒量很低，由cccDNA产生的HBsAg很少，但是整合的HBV DNA依然会产生大量的HBsAg，仅以血清中HBsAg的消失来判断HBV感染的缓解或“功能性治愈”，可能并不可靠。
对于慢性乙肝“功能性治愈”的研究仍不能止步，找到更为合适的替代指标，任重道远！
参考文献：
[1] Meier MA, Calabrese D, Suslov A, Terracciano LM, Heim MH, Wieland S. Ubiquitous expression of HBsAg from integrated HBV DNA in patients with low viral load [published online ahead of print, 2021 May 15]. J Hepatol. 2021;S0168-8278(21)00328-7. doi:10.1016/j.jhep.2021.04.051
[2] Liu J, Liang W, Jing W, Liu M. Countdown to 2030: eliminating hepatitis B disease, China. Bull World Health Organ. 2019;97(3):230-238. doi:10.2471/BLT.18.219469
[3] Ning Q, Wu D, Wang GQ, et al. Roadmap to functional cure of chronic hepatitis B: An expert consensus. J Viral Hepat. 2019;26(10):1146-1155. doi:10.1111/jvh.13126
[4] Rydell GE, Larsson SB, Prakash K, et al. Abundance of non-circular intrahepatic hepatitis B virus DNA may reflect frequent integration into human DNA in chronically infected patients [published online ahead of print, 2020 Sep 10]. J Infect Dis. 2020;jiaa572. doi:10.1093/infdis/jiaa572
[5] Thompson AJ, Nguyen T, Iser D, et al. Serum hepatitis B surface antigen and hepatitis B e antigen titers: disease phase influences correlation with viral load and intrahepatic hepatitis B virus markers. Hepatology. 2010;51(6):1933-1944. doi:10.1002/hep.23571