活/死细胞双染色试剂盒的工作原理丨AmyJet自研方案

活/死细胞双染色试剂盒（绿/红），提供了一种方便的测定方法，以评估细胞的活力，它基于使用两种探针同时测定活细胞和死细胞的方法，这些探针测量公认的细胞健康参数：质膜完整性和细胞内酯酶活性。该试剂盒利用可渗透细胞的绿色荧光染料 LiveDye（Ex / Em = 488/530 nm）染色活细胞，并使用不可渗透细胞的红色荧光染料 NucleiDye（Ex / Em = 535/617）用来染死细胞。

活/死细胞双染色试剂盒#AMJ-KT0005：

类型 细胞分析

检测方法 荧光显微镜，流式细胞术；

活细胞绿色荧光染料 LiveDye（Ex / Em = 488/530 nm）死细胞红色荧光染料 NucleiDye（Ex / Em = 535/617）

运输 冰袋运输

保存 请参阅说明书中各个组分的存储条件。

自发货之日起，在推荐温度下至少稳定 12 个月。

其它 默认使用 24 孔板进行实验

* 注意事项

1）为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）NucleiDye 是一个潜在的诱变因子，使用本试剂时应采取适当的防护措施

3）LiveDye 需要在干燥低温避光条件下储存，储存温度为-20℃。

需用户自行准备：

离心机

移液器及吸头

荧光显微镜或流式细胞仪

24 孔板（细胞培养用）

磷酸盐缓冲液 (PBS)

活/死细胞双染色试剂盒（绿/红）特点：

1.针对哺乳动物细胞染色进行优化

2.可用于使用流式细胞术或荧光显微镜，快速定量细胞活力

使用方法：

*[Note] 本实验中选择的细胞为 HeLa 细胞。由于不同类型细胞的zui佳染色条件不同，LiveDye和 NucleiDye 的zui佳染色浓度会有所不同。

一．试剂准备：

A.活细胞-绿色染料（LiveDye）：冰上避光放置。

B.死细胞-红色染料（NucleiDye）：冰上避光放置。

C.实验缓冲液 (10×) [Assay Buffer(10×)]：用 ddH20 稀释 10x 实验缓冲液，至 1x 实验缓冲液（工作液）。使用前预热到 37C。

D.染色工作液：每 1 ml 的实验缓冲液（1X）中，加入 1ul 活细胞-绿色染料（LiveDye）和 1ul 死细胞-红色染料（NucleiDye），混合均匀（适用于2个样品孔，每孔0.5ml）。如有大量样品，请成比例的扩大染色工作液配置。

二．

（一）荧光显微镜：

1.用预期的方法处理细胞，在不含诱导剂条件下孵育细胞建立阴性对照组；

2.对于贴壁细胞，在 24 孔板的盖玻片上种植和培育细胞，在 CO2 细胞培养箱中 37°C 培养至少 24 小时。先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3 min）。

对于悬浮细胞，直接离心(4℃, 300g, 5 min）收集细胞。

3.用 PBS 洗涤细胞两次，移除液体。

4.在 24 孔板中，每个孔加入 0.5ml 染色工作液来，37℃避光孵育 15-30 min。

5.用 PBS 洗涤细胞两次。

6.将盖玻片覆盖到载玻片上，尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。

*[Note] ：为了获得zui佳效果，可以使用抗荧光淬灭剂对其进行观察。

（二）流式细胞分析：

1.用预期的方法处理细胞。

*[Note] ：对于所有的处理和未处理的细胞样本，建议把未染色的对照组细胞悬浮在实验缓冲液（不含有 LiveDye 和 NucleiDye），用于流式细胞分析；

2.对于非贴壁细胞，收集 1-5 ×105 个细胞离心 (4℃, 300g, 5 min)，用预冷的 PBS 洗涤

2 次，弃去 PBS。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶（不含 EDTA）消化细胞，然后离心去上清。

3.用 500ul 染色工作液来悬浮细胞。

4.避光孵育 15-30 min。

5.使用流式细胞仪进行相应检测与分析。