真空冷冻干燥技术在疫苗研发与生产中的应用
整理排版｜药研
摘要：目前，世界各国都在积极应对新冠肺炎疫情（COVID-19）所带来的影响。新冠疫苗的研发与生产，已成为各国科研院所和医疗企业关注的焦点。同液体疫苗相比，冻干疫苗的运输和储存较容易，为解决疫苗冷链运输难题提供了一种可行方案。真空冷冻干燥技术作为冻干疫苗生产中的关键一环，对疫苗的安全性和有效性起着至关重要的作用。本文首先介绍了冷冻干燥的基本原理和冻干机的主要结构，随后阐述了疫苗的冻干工艺及冻干疫苗的优缺点，并进一步讨论了影响冻干疫苗质量的主要因素（包括保护剂的选择和冻干参数的设计）。作者希望本文所述内容，能为新冠肺炎疫苗的研发与生产提供些许帮助。
在全世界积极应对新冠肺炎病毒（COVID-19）的今天，疫苗的研发与生产已成为各国科研机构和医疗企业关注的焦点[1]。截至目前，全球处于研发阶段的新冠疫苗已达百余种[2]；中国国产新冠疫苗已于2020 年9 月亮相中国（北京）国际服务贸易交易会[3]；并先后在阿联酋、巴林、埃及、秘鲁等十多个国家和地区合作开展国际临床三期试验[4 ]，接种人数已达数十万人[5 ]，疫苗研发水平居世界前列[6]。
直接采用液体形式封装的新冠疫苗，往往需要全程进行冷链运输（温度一般是在-20℃~-80℃之间），这为新冠疫苗的储存、分发及接种带来不小的挑战[7]。同液体疫苗相比，冻干疫苗在正常冷藏温度下（2℃~8℃）即可保持稳定，热稳定性好，有效期长，运输和储存较容易，这为解决疫苗冷链运输难题提供了一种可行方案[8 ]。冻干疫苗，顾名思义，就是利用真空冻干机，将疫苗制剂干燥后得到的保持免疫原性的干粉。疫苗接种前，一般先用稀释液将疫苗干粉稀释至一定倍数后再使用[9]。目前，冻干型新冠疫苗的研发日益受到世界各国的关注与重视：俄罗斯加马列亚研究中心已经宣布研发出了抗新冠病毒的冻干疫苗[10]；美国辉瑞公司亦宣称正在加紧开发新冠疫苗的冻干制剂，并预计将于2022 年一季度上市[11]。我国幅员辽阔，地形复杂，气候多样，加速研发具有自主知识产权的冻干型新冠疫苗，对于实现新冠疫苗的大规模远距离运输，以及保障偏远地区人民群众的生命健康，具有十分重要的意义。真空冷冻干燥技术（简称冻干技术），作为冻干疫苗生产中的关键一环，对疫苗的有效性起着至关重要的作用[12 ]。本文从真空冷冻干燥技术的角度出发，浅析了其在疫苗研发与生产中的应用，以期为新冠冻干疫苗的研制提供些许助力[本文由药研公众号整理排版]。
1 疫苗的冻干工艺
1.1 冻干的基本原理
水有三相（即固态、液态和气态），根据热力学相关理论可知，降低压力可使水的沸点和冰点重合（如图1 所示）。再通过加热的方式，冰就可以不经液态而直接升华为气态[ 13]。冻干的基本原理就是利用低温低压下水的三态变化，先将需干燥的物料降温冻结，使物料中液态的水变成固态的冰[14]，然后在真空条件下对物料进行加热，使冰直接升华成水蒸气而除去，从而获得低温脱水的干燥制品[15]。一个典型的冷冻干燥工艺，其主要过程可分为恒压降温（图1“a-b 阶段”）、恒温降压（图1“b-c 阶段”）、恒压升温（图1“c-d 阶段”）这三个典型热力过程。
1.2 冻干机的基本结构
疫苗的冻干离不开冻干机。冻干机主要由干燥箱体、制冷系统、加热系统、真空系统、控制系统等组成[16]，一个经典的冻干机结构如图2 所示。在保证制品质量的前提下，选用合适的冻干机，可以实现经济效益和实用效果的双赢[17]。
1.3 疫苗的冻干步骤
疫苗的冻干工艺可基本概括为：预冻、升华干燥（又称第一阶段干燥）、解析干燥（又称第二阶段干燥）和包装四步骤：
（1）预冻阶段：预冻是将疫苗药液的温度迅速降低至其共晶点之下，从而在低温环境下将药液冻结成固体，目的是保护疫苗的理化性能和生物学性能，并为接下来的升华干燥做好准备[18]。共晶点就是其内部不同成分同时析出固体结晶时的混合物的温度，不同制剂的共晶点各不相同。一般来说，预冻阶段要在1~3 小时完成[19]，并且其冻结温度要比共晶点温度低5~10℃[本文由药研公众号整理排版]。
（2）升华干燥（第一阶段干燥）：升华干燥是在抽真空的状态下，对疫苗制剂中的冰通过升华的方式来移除，是冷冻干燥的主要过程。升华干燥先是个恒温减压过程，而后在维持真空的条件下，通过加热使冰升华逸出，是个恒压升温过程[20]。整个升华过程中，不允许冰出现熔化，否则会造成冻干失败。
（3）解析干燥（第二阶段干燥）：升华干燥完成后，药剂内所有的冰已逸出，但还留有未冻结的残余水分。为保证疫苗冻干制剂在存储期间的稳定性，解析干燥就是要把残余水分进一步降低，得到最终的疫苗干粉[ 21]。由于需要更高的能量才能去除结合水，因此解析干燥也是一个恒压升温过程。
（4）包装：疫苗在冻干箱内冻干后，一般需要进行真空或充氮密封，以防止疫苗冻干制剂被污染及回潮。真空封口应在成品检定中测定真空度；充氮封口应充足氮量，氮气标示纯度应不低于99.99%。由于胶塞和瓶口之间有漏气，真空压塞的样品，水分往往会随着药品的存放（尤其是低温存放）而上升。充气压塞的药品瓶，内外压力基本平衡，更适合长时间的存放[22]。
1.4 冻干疫苗的优缺点
冻干疫苗的优点是[23，24]：
（1）疫苗制剂在预冻前完成分装，从而保证了剂量的精确性；
（2）由于冻干是在真空和低温状态下完成的，因此不易发生氧化和热变性，可以最大限度地保持疫苗的理化性质和生物特性；
（3）固态的冰晶升华成为水蒸气后形成的疏松多孔（海绵状）结构，使冻干疫苗具有极好的速溶性和复水性，可迅速吸水溶解，恢复其原有特性；
（4）冻干疫苗易进行无菌化操作，污染相对减少，临床应用效果好，过敏等副作用少；
（5）冻干疫苗脱水彻底，含水量低，重量轻，适合长途运输及长期保存。冻干疫苗的缺点是[25]：设备投资大，维护费用高；干燥速率低，时间长，能耗大，因而冻干疫苗的成本较高。
1.5 常见冻干疫苗
由于冻干疫苗有着明显的优点，因此越来越多的疫苗采用冻干剂型。2020 年7 月2 日，国家药品监督管理局、国家卫生健康委员会发布公告，正式颁布2020 年版《中华人民共和国药典》。
在新版《中国药典（三部）》中，共记录有21 种冻干疫苗（含口服型和注射型）[26]，作者现将这些疫苗筛选出来并列于表1，以供读者参考。
2 影响冻干疫苗质量的因素
一般来说，影响疫苗质量的因素，主要是保护剂的选择和冻干参数的设计。
2.1 保护剂的选择
疫苗制品在整个冻干过程中存在的各种应力，包括冻结应力、低温应力、干燥应力等，这些应力在一定程度上会导致疫苗发生变性。为了减少疫苗在冻干过程中的损伤，需要在冻干前加入合适的保护剂，以尽可能地保护疫苗的稳定性和免疫原性。在疫苗中常见的保护剂，主要有糖、醇、氨基酸、聚合物、无机盐、蛋白质、表面活性剂等。这些保护剂在冷冻阶段发挥保护作用的为冷冻保护剂，而在干燥阶段发挥保护作用的为冻干保护剂。常见的各种保护剂如表2 所示。
2.1.1 糖类
糖是冻干疫苗中最普遍的一类保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂。疫苗的蛋白质分子中存在大量的氢键，水分子通过氢键和蛋白质分子相连接。在冻干过程中，糖类代替水分子，通过氢键与蛋白质上的亲水基团相结合。糖的保护作用与糖的种类、含量以及蛋白质的种类等有关[ 27]。在糖类中，蔗糖和海藻糖是目前公认的最有效的保护剂[ 28][本文由药研公众号整理排版]。
2.1.2 醇类
醇类也是一类常见的保护剂，其保护机理与糖类相似：醇类的羟基能替代蛋白质表面水分子的羟基，从而在蛋白质表面形成一层假定的水化膜，稳定了蛋白质的结构，防止蛋白质在冻干过程中发生变性[28-30]。
2.1.3 氨基酸
在冷冻过程中，氨基酸作为保护剂，其主要作用是提升制品的塌陷温度，防止因塌陷而破坏蛋白质的结构[28-30]。
2.1.4 聚合物
聚合物作为大分子保护剂，要与小分子保护剂（如糖类、醇类等）联合使用。由于聚合物的相对分子质量较高，能够提高产品的玻璃化转变温度Tg'，从而保证了冷冻干燥的顺利进行；此外聚合物黏度一般较大，能够阻止蛋白质间相互作用造成的变性[ 28，31]。
2.1.5 蛋白质
蛋白质类保护剂根据来源可分为两种：动物源性蛋白质和外来蛋白质。人血清白蛋白是一种优良的蛋白质稳定剂，能有效阻止蛋白质表面的吸附，对冻干过程中的多数蛋白都能起到保护作用[ 28，30]。
2.1.6 缓冲剂
许多病毒的蛋白质结构耐受的pH 值范围比较窄。因此，在制品中加入适当的pH 缓冲剂尤为必要。在实际使用中，应根据病毒或蛋白质特性及适合的pH 范围来确定缓冲剂[ 31]。
2.1.7 抗氧化剂
抗氧化剂是有着自由基清除功能的化合物，也是一种还原剂。抗氧化剂能够消耗氧或抑制氧化活性，防止冻干疫苗在贮存期间变质失活[ 29，31]。
2.1.8 表面活性剂
在冷冻阶段形成冰- 水界面会吸附蛋白质，这会破坏蛋白质的天然褶皱结构并导致其变性。加入表面活性剂可减少蛋白质的聚集，从而对蛋白质起到较好的保护作用[ 30，31]。
2.1.9 填充剂
填充剂既可防止活性组分随着水蒸气一同升华逸散，又可为冻干产品提供机械支撑作用。如配方中含有填充剂，常常需要在预冻阶段增加退火步骤以保证结晶完全[ 31]。
事实上，单独一种保护剂对疫苗的保护作用有限，为了使上述各类保护剂发挥其各自的作用，通常是采用两种以上的保护剂按照比例配制后使用[32]。对于不同的疫苗，其理化性质不同，因此所使用的保护剂配方也不同。筛选配方是疫苗研发中的重要一环，这通常需要进行大量的试验，从而获得复溶速率快，性能良好，质量稳定，成本较低的冻干疫苗配方。另外，配方里的固体含量会影响预冻以及干燥阶段。若固体含量小于2%，冻干结构的机械性能则会不稳定，由于缺少骨架支撑，产品外观可能会塌陷；并造成干燥过程中不能被粘在基质上的制品微粒，被逸出的水蒸气带到容器的塞子上，甚至会被带入真空室中造成污染。如果固体含量太多，不仅会影响配制时的溶解性及冻干后的复溶性，还会增加生产成本。因此，为获得均一稳定的冻干疫苗，需要将配方中的固体物质含量控制在合适范围内[33]。
2.2 冻干参数的设计
2.2.1 预冻阶段的影响因素
预冻阶段十分重要，在冻结中形成的冰晶形态和大小不仅会影响后续的干燥速率，还会影响冻干疫苗的质量和复溶时间。影响预冻过程的因素主要有冻结方式、冻结速率、冻结温度、冻结时间以及是否退火等。对上述参数进行试验，可得到产品最佳的冻结速度、升华速度以及溶解速度。
2.2.1.1 冻结方式的影响
冻结方式可分为全域过冷结晶与定向结晶两类。不同的冻结方式会产生不同的冰晶形态和大小，亦会影响到制剂的干燥速率和冻干质量，所以运用好冻结方式显得尤为重要。全域过冷结晶是指全部溶液处于相近或相同的过冷温度下进行冻结的方式，按冻结速率的快慢可分为慢速冻结（每分钟降温1℃）和快速冻结（每分钟降温10~15℃）两种。在全域过冷结晶中，冰晶成核温度和冻结速率是重要的参数。定向结晶是指一小部分溶液在过冷状态下进行冻结的方式。通常，采取定向结晶方式冻结的药液其干燥速率比全域过冷结晶的快。但无论采取哪种冻结方式，药液必须确保部分或全部实现玻璃化冻结，以保证其药性[34-37]。
2.2.1.2 冻结速率的影响
冻结速率的快慢对冻结出的晶粒大小和升华速率等均有直接的影响[ 38]。慢速冻结的冰晶较大，产品外观粗糙，存在冻结浓缩现象；其内部蒸气逸出通道尺寸较大，故升华速率快，但解析速率慢。快速冻结的冰晶较小，且没有冻结浓缩现象，加水复原时溶解快；但是升华阻力较大，存在不完全冻结现象，故升华速率慢[ 34-36 ]。
2.2.1.3 冻结温度的影响
冻结温度根据预冻方法及样品性质的不同而有所差异。一般来说，冻结温度与药液的共晶点有关，安全的冻结温度应低于其共晶点10℃左右。若冻结温度太低，则会浪费能源[ 34，35]。
2.2.1.4 冻结时间的影响
设置一个恰当的冻结时间可以保证药液在干燥之前被冻牢，以免因为抽真空而发生喷瓶。冻结时间根据板层面积、样品数量、传热介质的性质而定，一般在1~3h 内完全冻结[34-36]。
2.2.1.5 退火的影响
退火是把冻结疫苗升温接近其共熔点并保温一段时间，然后再降温到冻结温度的处理过程。在升华前增加退火工艺的原因主要是：①由于退火温度高于冻结样品的玻璃化转变温度Tg'，这会促进溶液中的结晶成分与浓缩液中未冻结的水结晶完全，从而强化结晶；②提高非晶相的最大冻结浓缩液的玻璃化转变温度Tg'，从而提高稳定性；③退火过程中的相行为与重结晶，可以降低因成核温度差异所导致的冰晶尺寸差异，调整冰晶形态以及大小分布，提高干燥效率。为了实现退火工艺的目的，在操作中须注意加热速率，退火温度和退火时间等工艺参数。由于目前对冻干中的退火机理的认识尚处于起步阶段，因此退火工艺参数的选取缺乏有效的依据[ 34-37 ]。
2.2.2 升华干燥阶段的影响因素
升华干燥是整个冻干过程中耗时最长的步骤，同时也是最复杂的步骤。其工艺受到温度、压力以及产品本身性质等参数的影响。升华干燥的理想状态是在保证疫苗质量的前提下，尽可能地提高升华速率，缩短升华时间，降低能耗。
2.2.2.1 升华温度的影响
升华温度既不能超过已干层的崩解温度，也不能超过冻结层的共熔点温度。升华温度如果远低于共熔点温度，则升华速率会明显降低，升华时间会显著延长；如果高于共熔点温度，则物料会发生熔化，干燥后的物料可能发生溶解困难，颜色加深等现象。因此升华阶段物料的温度要尽量接近但又不超过共熔点温度；越接近共熔点，升华速率越快。在升华干燥阶段，冻干箱的搁板是物料热量的来源，主要靠下搁板的热传导和上搁板的热辐射两种方式提供热量。因此搁板温度应控制在合理的范围内，一般根据升华温度、冻干箱内的压强以及冷阱温度三个因素来确定[ 34-36]。
2.2.2.2 箱内压强的影响
箱内压强过高时，药品吸收的热量会增加，药品自身温度会上升，当温度高于共熔点温度时，药品会熔化导致冻干失败；箱内压强过低时，不利于传热，药品升华速率反而会降低，亦会增加生产成本。一般来说，箱内压强控制在10~30 Pa时，不仅有利于热量的传递，还有助于升华的进行[35-39]。
2.2.2.3 冷阱温度的影响
冷冻干燥中制品和冷阱间的温差是水升华的驱动力，升华出的水分通过冷阱来捕集。由于药品温度受共熔点温度等因素的限制，因此应尽可能降低冷阱温度。一般来说，升华干燥过程中冷阱温度至少应低于物料温度20℃[34，37 ]。
2.2.2.4 升华速率的设计
升华速率直接影响冻干工艺的时间，其大小取决于提供给升华界面热量以及从升华界面通过干燥层逸出水蒸气的快慢。升华干燥过程中，若真空度不够或供热不足可能导致成品水分升华不完全，含水量偏高。过快的升华速度可能破坏已冻干层的结构；严重的会造成喷瓶，导致冻干失败。冷冻干燥的最终目的是获得均一合格的产品，因此升华速度的控制必须以此为标准。升华干燥的理想状态是在保证药品质量的前提下，尽可能地提高升华速率。提高升华速率的措施有：改变干燥室的压力；尽可能提高升华温度；减小已干层的厚度；提高已干层的导热性；降低冷阱温度等。一般来说，性能良好的冷冻干燥机的升华时间较短[ 34]。
2.2.3 解析干燥阶段的影响因素
解析干燥阶段常见的控制参数是物料温度、箱内压强、冷阱温度以及干燥时间。该阶段要除去产品内结合水，因此搁板需要提供足够的热量以克服水的结合力，将产品升温到其最高许可温度并维持几小时直到冻干结束[39]。物料的最高许可温度视物料的品种而定，一般控制在20~40℃[ 40 ]。若物料温度超过其极限值，疫苗中的有效成分会变质，疫苗的免疫效果会降低。为了使结合水顺利除去，冻干箱内应维持高真空，以使物料内外形成较大的蒸汽压从而提高传质效率[ 34 ]。此外，在解析干燥过程中应尽可能的降低冷阱温度。升华干燥所需的时间由制品的水分残留量决定，对于含有热敏性成分的疫苗，为防止其中的成分变性或失去活性，高温时间不宜过长。
综上可知，冻干操作中每个阶段的参数设计都直接关系着冻干疫苗的质量，且不同的疫苗产品也有不同的冻结和干燥特性，因此应在上述设计原理的基础上，进一步开展个体研究，优化冻干曲线，提高干燥速率，降低能耗[ 41]。
3 结论与展望
冻干疫苗的研发与生产，关系到人民群众的身体健康。冻干参数和保护剂配方的设计，对冻干疫苗的质量起着至关重要的作用。作者认为，基于已有冻干疫苗的生产工艺，并结合新冠疫苗自身的特点，可以加速摸索出适合新冠疫苗的冻干工艺路线。随着我国对新冠疫苗研发的不断深入，相信在不久的将来，具有自主知识产权的冻干型新冠疫苗也将相继面世，从而更好地为人民健康提供保障。
参考文献：略