3D细胞培养，你了解吗？
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导读
通过模仿体内环境的特性，并利用传统的细胞培养研究工具，三维细胞模型提供了独特的视角来观察干细胞的行为、组织器官和肿瘤的发展过程。建立体外三维培养模型将有助于跨越二维细胞培养与动物实验之间的鸿沟，有利于加速癌症生物学和组织工程领域的转化研究。
体外3D模型的关键特性就是能够模拟体内特定的细胞行为，使得能够精确预测组织发育和形态形成、细胞分化、药物和毒性筛选试验中基因型和/或表型对化合物的反应。一些更基础的3D模型还在不使用基质胶底物情况下悬浮培养细胞团。但是，多数更复杂的3D细胞培养模型都会使用水凝胶基质或固态支架。大量的材料和制造技术被用于开发具有不同物理和生物特性的支架，以满足体内不同类型细胞的需求。
3D细胞培养的主要类型
水凝胶
固体支架
磁力悬浮
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水凝胶三维培养
天然的细胞外基质来源的水凝胶最被广泛用于体外3D细胞培养应用。水凝胶是由交联的多聚链或复杂的天然或合成蛋白分子组成的网络构成。由于含大量水，水凝胶具有和天然组织非常相似的生物物理学特性，因而可以作为高效的3D细胞培养基质。水凝胶可以单独或和其他技术（如固体支架、可通透支持物、细胞微阵列和微流体设备）联用。在3D培养系统中水凝胶有多种使用方法：包括为固体支架在内的多种细胞培养表面做包被，也可以将细胞包裹或夹在基质中间。水凝胶基质中细胞的形态、生长和功能取决于生物物理学和生物化学特性，以及如通透性和基质硬度在内的物理特性。
天然来源的细胞培养水凝胶通常由蛋白和ECM成分（如胶原、层纤连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、壳聚糖等）构成。由于来源于天然成分，存在多种有助于多种细胞存活、增殖、功能实现和发育的内源因子，这些凝胶本身具有生物兼容性和生物活性，有利于细胞功能的完成。
细胞外基质（ECM）具有多种重要功能。首先，它能够提供复杂的纳米级的结构蛋白架构（如胶原、层纤连蛋白和纤连蛋白），构建细胞微环境中的机械特性。细胞通过表面整合素感受机械力，并结合ECM蛋白，粘附模体。3D系统的细胞粘附会导致并影响一系列的的后续细胞反应，这些反应和2D表面上生长的细胞相比更接近于生理情况。而且，ECM对隔绝可溶性生物分子和生长因子，通过时间和空间上的限制来控制这些信号分子的释放来指导包括细胞迁移、基质降解和沉积的过程至关重要。ECM模型重构对于实现组织内稳态，尤其是在发育和疾病过程中，是非常必要的。因此，想要真正地模拟体内的ECM，需要构建具有ECM机械和化学特性的3D培养模型，要考虑到细胞生长和发育的动态和可控过程，而不只是停留在细胞接种的初级阶段。
天然水凝胶也存在缺陷，如从动物来源，以及成分上的批次间差异。而且，它们包含着像生长因子这样的内源生物活性成分，虽然有利于构建一些3D模型，但有些情况下也会混淆所特定的细胞表现或反应。
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固体支架三维培养
3D细胞培养设计支架需要考虑的重要问题就是支架内部结构的尺度和局部解剖结构。体内的ECM提供着支撑细胞的错综复杂的纳米级基础结构，指导性地控制着细胞的行为。结合在微尺度结构支架上的细胞会像培养在扁平表面一样变平并扩散。细胞环境的地貌即便发生了细微的纳米级变化也会导致不同的细胞行为。除了大小和结构，用于构建的材料、表面化学特性、基质硬度、通透性和机械力都会对细胞粘附、生长和行为产生显著的影响。
目前用于支架的人工合成可降解聚合物主要包括脂肪族聚酯、聚偶磷氮、聚酸酐等。其中研究最多的是脂肪族聚酯，特别是聚乳酸（PLA）、据乙醇酸（PGA）及其共聚物等。
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磁力悬浮三维培养
美国莱斯大学和德克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心的研究人员开发出一种生物装配器（bioassembler）。这个系统使用磁力让细胞悬浮，并促使细胞生长成三维的形状。尤其适用于培养肝脏和心脏这种细胞密度比较大的实体器官。
2D细胞培养与3D培养的比较
人胶质母细胞瘤细胞SNB-19
左：标准2D培养效果图 右： 3D培养板培养效果图
细胞增殖，分化和代谢等生理活动都严重受到微环境的影响。当前细胞生物学研究大多还是在二维平面培养进行，这种平面培养、生长方式与机体内立体环境差别很大，导致细胞形态、分化、细胞与基质间的相互作用以及细胞与细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在明显差异。2D和3D环境下培养的细胞相比较，诸多生理指标都显著不同，例如原代小鼠乳腺管腔上皮细胞(mammary luminal epithelial cells, MEC)在3D基底膜基质中增殖的时间明显长于2D培养环境；更有甚者，有时药物作用于2D培养的细胞呈现的效应与3D细胞相反。3D培养可以设计模拟体内的生理环境，让细胞在生理行为上与机体实际的生理环境更接近。
正因为此，很多药物研发企业和护肤品生产企业更倾向于使用3D培养细胞（或组织类似物）来开展实验、研究：3D培养让药物研发企业相当程度上摆脱了伦理3R对动物实验的约束，缩短了研发周期，提高了结果可信度，研发少走了弯路，从而节省了成本，提高了企业的竞争力。可以预见，未来在高通量，自动化，低成本，广应用性和高预测性等方面3D培养将逐步突破并日趋成熟、完善，2D培养向3D的转变成为必然的发展趋势和时代潮流。
同种细胞在2D和3D不同的生长环境中，信号通路中的蛋白表达差异
药物筛选中出现的差异
所以可以总结出：
2D细胞培养：在药物研发和细胞生物学研究中具有至关重要的功能，但在模拟体内环境具有局限性。
3D细胞培养：类似于体内环境的3D模型能够更有效的支持生物学相关的实验。
3D培养的应用方向
1.干细胞分化和类器官生成
2.癌症和肿瘤细胞生物学
3.癌症共培养模型
4.组织共培养模型
5.药物发现
6.毒性筛选
3D培养的缺点与局限
3D培养对药物研发和毒性测试意义重大，但是现在也有一些问题尚待解决。包括：当前多数系统还不能模拟体内的生物机械动态特性；动物源或人源的支撑材料有一定病原风险，且这类材料可能存在批次差别性，在重复性上不及合成的支架材料。支架培养方法在RNA、蛋白提取时需要注意，当然，当前已经开发了酶或是其它试剂在不损伤细胞条件下消化去除这类支架，另外，一些生化测定、图像扫描和荧光检测方面，支架是否存在影响，在选择产品时需要考虑到。
总体上说，材料科学与生物学的结合使当前3D培养方式越来越多样化，科研人员的选择空间很大，可在比较中找到最适合自己的方法。众多的3D培养方法重点关注如何让3D体系更加接近人体实际环境，而对药物研发企业，他们除了模拟实际环境，还要求高效、自动化和可承受的使用成本。当前3D分析尚须实现飞跃，从而实现3D培养体系工业化应用便捷和高效。
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