科研 | 借助转录组及代谢组研究柑橘叶片和花中挥发性成分（国人佳作）
编译：Jerry，编辑：十九、江舜尧。
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柑橘挥发性成分研究主要集中在果实，其叶、花的挥发性成分鲜有报道。柑橘叶、花中富含具有特殊芳香的挥发性成分。为了探究柑橘叶、花中的挥发性成分，利用62种不同柑桔种质的叶片和25种不同柑橘种质的花进行了转录谱、挥发油代谢谱研究。在62份柑橘叶样品和25份柑橘花样品中，分别鉴定出196个、82挥发性成分。挥发性萜类为主要成分，在叶中种类高于果。共有34个挥发性萜类在至少20种叶片中检出，其中31个在野生、半野生种质的叶片中有过量积累。该结果分别与甲羟戊酸生物合成途径的5个基因、MEP生物合成途径中的一个关键基因的表达水平一致，并且与栽培种质相比，MEP途径中香叶基焦磷酸合成酶为低表达水平。与花蕾阶段相比，完全开放的花中，萜醇水平增加、桧烯含量下降。此现象在甜橙中尤为明显。另外，本研究鉴定了一个单萜合成酶基因，体外验证其为香桧烯合酶。
论文ID
原名：Transcriptomic and metabolomic analyses provide insight into the volatile compounds of citrus leaves and flowers
译名：转录组及代谢组分析有助了解柑橘叶片和花中挥发性成分
期刊：BMC Plant Biology
IF：4.03
发表时间：2020.01
通讯作者：徐娟
通讯作者单位：华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学教育部重点实验室
DOI号：10.1186/s12870-019-2222-z
实验设计
本研究以柑橘属62种不同种质的叶片、25种不同种质的花朵为实验材料，以气相色谱分析挥发油组成及含量，并进一步进行CPCoA分析；另外对2份野生型种质和2份栽培型种质进行了转录组比较，并使用RT-qPCR验证了MVA、MEP途径中相关基因表达情况；以红肉脐橙两个花期的花朵为材料，进行了比较转录组研究，并根据挥发油含量和基因表达情况进行关联性分析，对筛选出的基因进行了细胞水平的体外表达和功能验证。
结果
1柑橘叶中检出的挥发性成分
借助NIST质谱库，初步从62份柑橘种质中检出196个挥发性化合物，其中57个可用标准品鉴定。196个化合物分为16组，包括19个单萜、15个单萜醇、5个单萜醛、5个单萜酮、5个单萜氧化物、6个单萜酯、72个倍半萜、16个倍半萜醇、一个倍半萜氧化物、两个倍半萜醛、5个醇、15个醛、5个酸、5个酯、4个酮、16个其他化合物。
不同柑橘种质之间的总挥发性成分含量介于0.13 ± 0.01 mg/g （兴山酸橙）到 28.69 ± 1.94 mg/g （瑶乡柑），不同种质之间化合物种类从13（HB柚）到69（瑶乡柑）不等（表1）。
与果皮部分相比，不同柑橘种质之间叶片的主要化合物种类差异更大。例如，大翼橙中含量最高的化合物是香茅醇、乙酸香叶酯、反式罗勒烯；宜昌橙中主要含有反式罗勒烯、乙酸芳樟酯、α-蒎烯、 (E)-β-法尼烯、γ-榄香烯；香橙主要含香桧烯、 γ-萜品烯、D-柠檬烯、大根香叶酮D；枸橼中主要成分为D-柠檬烯、α- 柠檬醛、β-柠檬醛、香茅醛；柚主要含有β-蒎烯、(+)-二环大根香叶烯和石竹烯；宽皮柑橘主要含有芳樟醇、反式罗勒烯、β-榄香烯；甜橙主要含有香桧烯、反式罗勒烯、3-蒈烯；酸橙主含乙酸芳樟酯、 芳樟醇、 石竹烯、β-蒎烯。
共有43个化合物在至少20份种质中检出，包括34个萜类。值得注意的是，当中的31个在野生、半野生种质中含量更高。分别有：YXG中的八个萜类（香桧烯、β-月桂烯、 D-柠檬烯、别罗勒烯、α-榄香烯、β-榄香烯、(−)-葎草烯、大根香叶酮D）；聂都野橘中的7个萜类（莰烯、β-蒎烯、异斯巴醇、大根香叶烯D-4-ol、 反式罗勒烯、 α-柯巴烯、异松油烯）；印度酸橘中的γ-榄香烯、大根香叶烯B；武隆酸橘中的 (+)-δ-杜松烯和(+)-二环大根香叶烯；木里香橼和纽荷尔脐橙中的α-水芹烯和3-蒈烯（表2）。
62份种质可以分为7个种。多数大翼橙和宽皮柑橘中的总挥发油含量高于10mg/g；多数宜昌橙、香橼、甜橙、酸橙总挥发油含量在3~10mg/g之间；多数柚类总挥发油含量小于2.5mg/g（图1）。在个柑橘类物种中，宽皮柑橘挥发油成分数量最多，甜橙最少。
在15份宽皮柑橘种质的叶片中检出了140个挥发性化合物。总挥发油含量从GQ.1的2.39 ± 0.33 mg/g到YXG的28.69 ± 1.94 mg/g不等，并且多数宽皮柑橘种质中的共有化合物超过了50种（表1）。除了茶枝柑和红橘之外，单萜组占宽皮柑橘挥发油含量的42~78%。茶枝柑和红橘叶片特异性地累积了甲基邻氨基苯甲酸，分别占挥发油含量的69.88%和43%。宽皮柑橘种质中，挥发油主要成分为D-柠檬烯、芳樟醇和香桧烯。倍半萜只占茶枝柑总挥发油的5%，显著低于其他宽皮柑橘种质中的含量。
在10份宜昌橙种质中，检出了128个挥发性化合物，包括76个倍半萜，占总挥发油含量的30%~50%（表1）。在香橙中检出了55个化合物，包括47个萜类。在这128挥发性化合物当中，73个是宜昌橙独有，13个是香橙独有。尽管香橙中检出的化合物数量不及宜昌橙，但香橙的总挥发油含量更高。值得注意的是，香橙中香桧烯、β-荜澄茄烯、大根香叶烯D和β-榄香烯含量显著高于多数宜昌橙种质（10倍以上），而宜昌橙中反式罗勒烯和(+)-δ-杜松烯含量则显著高于香橙（10倍以上）。
在9份香橼种质中检出了 119个挥发性化合物，总挥发性成分含量从云江香橼的4.03 ± 0.44 mg/g到红檬的15.52 ± 0.84 mg/g不等，化合物数量从香橼的41种到青柠檬的65种不等（表1）。单萜是香橼类种质的主要成分。红檬叶片含有60种挥发性成分，其挥发油含量最高，D-柠檬烯含量最高，其次是 (Z,Z)-α-法尼烯和石竹烯。
12份柚类种质中检出了73个挥发性成分。总挥发油含量从Kaopan柚的0.22 ± .03 mg/g到沙田柚的2.15 ± 0.12 mg/g不等（表1）。多数柚类种质中含量最高的成分为单萜，占挥发油总量一半以上。柚总挥发油含量较低(1.90 ±0.26 mg/g)，几乎不能检出倍半萜。
在8份酸橙和3份甜橙种质中分别检出88、64个化合物。两者含量最高的成分均为单萜。狗头橙中可检出52种成分，含量最高为β-蒎烯，其次是芳樟醇、石竹烯、香桧烯和反式罗勒烯。小叶酸橙中含量最高为乙酸芳樟酯；德福尼亚酸橙中含量最高为芳樟醇和(+)-二环大根香叶烯；甜橙中反式罗勒烯和香桧烯含量最高。
表2 柑桔不同种质叶中高丰度的34种萜类化合物
图1 柑桔叶片总挥发性成分。以上数据显示，在所有62份柑橘种质中，总挥发性水平最高的有14份种质。LSM：宽皮柑橘；PA：橘；CI：枸橼；SO：酸橙；IC: 宜昌橙；SW：甜橙；PU：柚子；TRI：枳。
2 基于柑橘类叶片挥发性成分的CPCoA
基于叶片挥发性成分，CPCoA将62份柑橘种质分为6个类群。第一类是宽皮柑橘；第二类是宜昌橙；第三类是酸橙；第四类是柚；第五类是橘；第六类是枸橼。总体而言，同一物种的不同样品可以聚到一类。香橙中的三份种质（GuanXian xiangcheng No.3、 Qianjiang xiangcheng No.3 and Ziyang xiangcheng）与宽皮柑橘聚为一类（图2）。
3 野生及栽培柑橘种质的单萜、倍半萜生源途径
在多数野生、半野生种质的叶片中，挥发性成分的种类和含量均高于栽培者，尤其是单萜、倍半萜类（图3c）。外果皮和汁胞中亦有此现象。本研究分别比较了两种野生种质（JYYJ和DXYJ）和两种栽培种质（BTJ和QTJ）的萜类相关基因的表达水平。在野生种质中， MVA通路的3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A合成酶-2（HMGS-2）、甲羟戊酸激酶（MVK）、磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）、法尼基焦磷酸合酶以及MEP通路的香叶基焦磷酸合酶（GGPPS）的表达量显著高于栽培种质（图3ab），而这些酶参与了类胡萝卜素、脱落酸（ABA）、二萜代谢。
为进一步明确野生及栽培种质中MVA、MEP通路中与萜类相关基因的表达水平，我们还采集了10份野生种质和10份栽培种质叶片进行RT-qPCR分析。野生型、栽培型种质的多数基因表达水平在RT-qPCR和转录组数据中趋势一致。RT-qPCR结果显示，野生种质的MVA通路中多数基因的表达水平高于栽培型，MEP通路上的基因表达量则没有显著差异。在野生型中，GPPS表达量高于栽培型，而栽培型的GGPPS表达量更高（图4）。
图3栽培柑桔和野生或半野生种质叶片中两种萜类生物合成途径的差异基因表达模式。a：植物萜类化合物的生物合成途径；b：MVA和MEP途径中差异表达基因的研究；c:野生或半野生种和品种叶片中单萜和倍半萜积累的差异。
图4 RT-qPCR法分析野生和半野生柑橘种质中MVA途径4个基因和MEP途径2个基因的转录水平。Actin为内参基因。C：栽培柑桔种质；W:野生或半野生柑桔种质。
4 柑橘类花朵的挥发性成分谱
从25份种质花朵的两个绽放阶段（花蕾期、盛花期）中共检出82个挥发性成分，包括60个萜类和22个其他类化合物。总挥发油含量从GQ1（花蕾期）的1414.33 ± 51.39 μg/g到星露比葡萄柚（花蕾期）的6235.60 ± 142.94 μg/g不等，化合物数量从凤凰柚（花蕾期和盛花期）的19个到星露比葡萄柚（盛花期）的45个。萜类是柑橘类花朵挥发油中含量最高的组分，除了红橘（约39%），在其他种质中占到80%。花朵中主要化合物的种类在不同种质中有所差别：甜橙中含量最高为香桧烯，其次是D-柠檬烯和芳樟醇；宽皮柑橘类以γ-萜品烯含量最高，只有红橘例外（二甲基邻氨基苯甲酸）；柚类含量最高为D-柠檬烯和β-罗勒烯；柠檬中D-柠檬烯、β-蒎烯、β-罗勒烯含量最高。和叶片挥发油相反，8-羟基芳樟醇仅存在于花朵中，花中α-甜橙醛、 香桧烯、 橙花叔醇、法尼醇含量远高于叶片，而芳樟醇含量与叶片相当。然而，石竹烯、大根香叶烯D等多数挥发性化合物在花中含量更低。
对于同一种质，不同开放阶段花朵挥发油组成相似。但甜橙盛花期的芳樟醇、8-羟基芳樟醇、橙花叔醇、法尼醇显著增加，香桧烯则减少。柚类盛花期的芳樟醇、橙花叔醇、法尼醇含量显著上升，而β-月桂烯、β-蒎烯、香桧烯减少。宽皮柑橘和柠檬盛花期的法尼醇含量升高。
5 红肉脐橙花朵差异基因表达谱和STPS的特征
在红肉脐橙花中检出36个挥发性成分，包括27个萜类，其中香桧烯含量最高。采用两个开放期的花朵作转录组分析，共获得35.8G高质量碱基对（每个样本至少5.2G）。(Additional file 14: Table S8).约96.16%~98.19%的总序列可比对到甜橙基因组。其中，总序列的89.67%~98.19%有特异性比对，5.64%~6.59%可以匹配到多个位点。总体上，FPKM值大于0.5的有表达基因中，F1阶段有18654个，F2阶段有18267个。F1、F2的平均FPKM值分别为33.17、44.53，有表达基因中FPKM值介于1到100的分别占总独立基因的86.17%、85.24%。1013个基因仅在F1阶段表达，626个基因仅在F2表达。
RNA-seq共鉴定出2528个差异表达基因（| Log2FC | > 1.5 and P-value < 0.05）。GO注释和富集分析结果主要和植物代谢产物有关，如木质素、苯丙素、次生代谢产物和芳香族化合物。与花蕾阶段相比，盛花期显著上调的基因有1281个，显著下调基因有1247个。在差异表达基因当中，有47个TPS和65个CYP450基因。萜类成分与基因表达水之间的关联性分析表明，香桧烯含量与Cs3g04360之间有最高的Pearson相关系数（0.95）。芳樟醇含量和10个TPS基因(Cs5g23540、Cs5g22980、Cs2g03570、Cs3g21560、Cs2g22180、Cs2g07250、Cs2g07240、Cs2g06470、Cs2g07230 and Cs7g17670)的Pearson相关系数大于0.9。8-羟基芳樟醇含量与36个CYP450基因的Pearson相关系数大于0.9，当中包括7个CYP76C亚家族基因。这些候选基因可能与相应的挥发性萜类合成相关。
根据较大的Pearson相关系数，从红肉脐橙花中克隆得到一个名为STPS的TPS候选基因。其具有1824bp的开放阅读框，编码607个氨基酸，与Cs3g04360相似，但有10个差异残基。该蛋白含有TPS活性必需的二价金属结合域（DDXXD），并且与环状单萜合成酶均有RRX8W模体。STPS在盛花中表达量显著下调。
利用大肠杆菌重组蛋白，并使用镍离子亲和层析及空间排阻色谱纯化得到该蛋白。蛋白印迹表明原核表达载体被成功构建。通过体外加入GPP或FPP，溶剂提取以后进行气相-质谱分析，显示STPS催化GPP转化为单萜，包括61.26% 香桧烯、18.68% D-柠檬烯、7.89% 芳樟醇、5.65%反式罗勒烯、4.32% β-月桂烯和2.20% α-蒎烯（图5）。以FPP为底物，未检出萜类化合物的生成。
图5重组STPS体外酶促反应产生的单萜类化合物。pET-28a(+)+GPP：加入GPP的pET-28a(+)空载体；STPS+GPP:加入GPP的STPS蛋白。标准品：化合物鉴别采用6种标准品。P1：α-蒎烯，P2：香桧烯，P3：β-月桂烯，P4：D-柠檬烯，P5：反式β-罗勒烯，P6：芳樟醇。
结论
本研究鉴定了柑橘属植物叶片、花朵中的挥发性成分。结果表明，野生、半野生种质富含31个重要萜类。转录组和RT-qPCR分析显示，与栽培型种质相比，野生型、半野生型种质大部分基因高水平表达，可能是由于驯化对该类植物叶片中挥发性萜类生物合成产生了负面影响。盛花期花朵的香甜气味可能由于4种萜醇含量增加所致。本研究显示，柑橘属植物叶片可作为挥发油生产的优良原料，也是研究萜类生物合成和萜类代谢调控的良好素材。
评论
柑橘属植物具有重要的经济价值，现有研究多集中在果实方面，其他部位研究较少。本研究为了探究柑橘叶、花中的挥发性成分，利用多份叶片、花朵种质进行挥发油转录谱、代谢谱研究。聚类分析为若干种柑橘属植物的分类处理了化学分类学的依据，而挥发油成分谱也有助于我们了解不同物种之间化学成分的差异，为以后的开发利用提供了参考。
通过栽培型、野生型种质叶片的转录谱、挥发油成分谱关联性分析，我们得以了解造成两者品质差异的基因水平的线索，而这种差异很可能是人工选育压力所致。最后，采用红肉脐橙不同开放期的花朵样品作转录谱、挥发油成分谱关联性分析以及后续的体外表达与功能验证，则揭示了花香生成的分子奥秘。
本文综合、熟练运用聚类分析、关联性分析等统计工具，在成分-调控机制之间构建了逻辑的桥梁，是值得广大研究者参考的一篇佳作。
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