科研 | Plant biology:mRNA腺苷甲基化酶在pri-miRNA上沉积m6A调控拟南芥miRNA的生物合成

编译:夕夕,编辑:夏甘草、江舜尧。

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导读

在拟南芥中,METTL3同源基因mRNA腺苷甲基化酶(MTA)将m6A引入到植物转录组的各种编码和非编码rna中。在本研究中,作者表明MTA缺陷突变体(mta)降低了microRNAs (miRNAs)的水平,但积累了pri-miRNAs。此外,pri-miRNAs被MTA甲基化,RNA结构探测分析显示,在MTA突变植物中,这些转录本茎环区域的二级结构有所下降。作者证明了MTA和RNA聚合酶II和TOUGH (TGH)之间的相互作用,TOUGH是一种植物蛋白,需要早期步骤的miRNA生物发生。MTA和TGH对于具有RNA聚合酶II的DCL1和HYL1的有效共定位都是必需的。作者认为,由MTA依赖的m6A甲基化状态诱导的miRNA前体的二级结构,以及MTA和TGH之间的直接相互作用。因此,MTA突变体中缺乏MTA,干扰了pri-miRNA加工,导致miRNA积累减少。此外,作者的研究结果表明,miR393b水平的降低可能是mta突变植物生长素应答表型受损的原因之一。

论文ID

原名:mRNA adenosine methylase (MTA) deposits m6A on pri-miRNAs to modulate miRNA biogenesis in Arabidopsis thaliana

译名:mRNA腺苷甲基化酶(MTA)在pri-miRNA上沉积m6A调控拟南芥miRNA的生物合成

期刊:plant biology

IF:4.2

发表时间:2020.7

通讯作者:Artur Jarmolowski

通讯作者单位: Department of Gene Expression, Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Faculty of Biology, Adam Mickiewicz University, 61-614 Poznan, Poland

DOI号:10.1073/pnas.2003733117/-/DCSupplemental.

实验设计

结果

1 m6A缺失导致miRNA生物发生受损
为了评估m6A对miRNA生物形成的可能影响,作者对4周大的拟南芥植株WT Col-0和m6A水平严重降低的突变株(mta突变株)的莲座叶进行了小RNA (sRNA)测序。作者的测序数据显示,与WT植株相比,mta突变体中成熟miRNA的总体丰度有所下降。鉴定了60个差异表达的miRNA,其中51个miRNA下调,只有9个miRNA上调(图1A)。任意选择的6个miRNAs (miR159b、miR169a、miR319b、miR396b、mir399a和miR850)进行RT-qPCR,证实了mta植物中miRNA的下调(图1B)。
接下来,作者利用本课组开发的mirEX2平台(www.combio.pl/ mirEX2)对低甲基化植物(mta突变体)中的初级miRNA(pri-miRNAs)水平进行了研究。该平台利用了298个引物对,特别用于拟南芥pri-miRNA定量RT-qPCR。在检测的298个pri-miRNAs中,作者的样本中有68个pri-miRNAs未检测到,剩下230个有待进一步分析。RT-qPCR结果显示,85个pri-miRNAs的积累变化(WT vs. mta)具有统计学意义(P≤0.05,n = 3);其中56个(约为66%)被上调,29个被下调(图1C)。将RT-qPCR结果与sRNA测序数据进行比较,作者发现有20对同源pri-miRNA/ miRNA对具有较高的pri-miRNAs积累量和较低的成熟miRNA水平(图1D)。这些结果表明,在没有MTA的情况下,这些pri-miRNAs的加工过程受损。
图1 在mta突变植物中,miRNA的生物发生受损
2 拟南芥pri-miRNA被MTA m6A-甲基化
在m6A甲基化减少的情况下,pri-miRNAs会积累,而miRNA水平会下降,这就意味着,m6A的存在可能是一些pri-miRNAs正确处理的必要条件。因此,作者使用m6A-RNA免疫沉淀然后测序(m6A-IP Seq)检测prio-miRNAs的甲基化状态。这种方法并不等同于通常使用的MeRIPSeq,因为作者避免了polyA RNA的碎片化。作者共识别出14870个基因的转录本(15562)在mta突变体中消失,表明这些基因转录本被甲基化。将作者的数据与已发表的数据进行比较,作者发现,作者的数据与Shen et al.和Anderson et al.的数据分别有2868(80%)和3100(65%)的基因重叠,其中共有基因为930个。
miRNAs在基因间区可以作为独立的转录单元被编码,也可以嵌入与宿主蛋白基因共享的转录单元的蛋白编码基因内。为了从m6A-IP Seq数据中进行分析,作者只选择了那些独立转录单位的miRNA基因的转录本。使用这种方法,在WT vs mta突变体分组中,11个MIR基因的转录本表达量上升了1.5倍。表明这些基因在野生型中发生m6A甲基化和mta突变体中未发生甲基化(图2A)。
为了验证这些pri-miRNAs是MTA定向甲基化的真正靶基因,作者使用抗GFP抗体和带GFP标记的MTA (35S:MTA-GFP)株系进行RNA IP (RIP)实验。作为对照,作者使用了WT Col-0背景下仅表达GFP的植株。对核片段进行RIP,然后对oligo(dT)引物的cDNA进行RT- qPCR。选择了18个pri- mirna进行RT-qPCR验证,其中除4个外,MTA-GFP样本与GFP对照相比均有显著的富集(图2B)。这表明pri-miRNAs经常被MTA结合。综上所述,这些数据表明MTA至少结合并甲基化了一组pri-miRNAs,并且这种结合促进了它们向成熟miRNAs的加工。
图2 至少有一组pri-miRNAs被m6A甲基化
3 m6A缺乏会影响pri-miRNAs的茎环结构及其结合HYL1的能力
m6A对RNA二级结构的影响已经得到很好的证明。这种由m6A诱导的RNA结构改变被称为“m6A开关”。这些m6A开关影响RNA结合蛋白识别RNA分子的能力。作者使用蛋白相互作用谱分析(PIP-seq)来确定这种结构变化是否可以在miRNA前体中观察到,从而在miRNA生物发生中观察到。利用这种方法,经过单链和双链特异RNase处理后,可以分别检测出双链rna和单链rna,从而作者能够识别和区分miRNA前体的结构化和非结构化区域。作者注意到mta突变体中双链或单链RNase(s)的核苷酸可及性发生了改变。作者的数据显示,与WT植株相比,mta突变体中的pri-miRNA茎环结构水平显著降低(图3A)。通过使用pip-seq衍生的结构评分约束折叠算法,我们获得了m6a甲基化pri-miRNAs中的几个例子的2D结构模型。所提出的模型代表了每个RNA可能存在的多种折叠模式中最常被询问的结构形态。这些基于数据的结构模型表明,与甲基化的pri-miRNAs相比,在缺少m6A标记(mta突变体)的情况下,包含miRNA/miRNA stem区域的pri-miRNA区域倾向于处于非配对构象。
根据这些数据,作者推断,这些结构的改变在原则上可以影响HYL1与这些前体的结合。HYL1是一种双链RNA结合蛋白,在miRNA生物形成中发挥重要作用。因此,作者利用RIP (HYL1-RIP)和RT-qPCR技术研究了WT和mta突变植株中HYL1与pri-miRNAs的结合。作者发现,与WT相比,在mta突变体的HYL1-IP样本中,检测到的10个pri-miRNAs中有7个明显较少(图3B)。
图3 在没有m6A的情况下,miRNA前体的结构及其与HYL1的结合发生改变
4 MTA作用于miRNA生物发生的早期阶段
虽然MTA与RNA Pol II相互作用是其在总体上对RNA Pol II转录酶进行甲基化的指示,但作者研究了参与miRNA生物形成的特定蛋白是否可以与MTA相互作用。为了解决这一可能性,作者对可能的MTA相互作用物进行了筛选,涉及miRNA生物形成的早期步骤。作者使用荧光寿命成像显微镜(FLIM)进行了荧光分析。由于FRET只有在两种蛋白质距离不到纳米时才会发生,所以FRET- flim可以帮助量化蛋白质-蛋白质的直接相互作用。该FRET-FLIM分析证实了MTA和TGH的密切联系和相互作用(图4),但在其他被测蛋白中未见这种相互作用。因此,作者确定miRNA生物发生因子TGH是MTA的同伴。
图4 MTA与miRNA生物发生相关蛋白TGH相互作用
5 缺少m6A/MTA会影响Microprocessor的复杂组装
在确定TGH是MTA的相互作用后,作者重点研究了TGH突变体中pri-miRNAs的m6A甲基化状态。m6A-IP和RT-qPCR结果显示,除了两种pri-miRNAs外,tgh突变体中pri-miRNAs的m6A甲基化总体上没有显著降低。这一结果表明,m6A的甲基化并不需要TGH,而MTA在miRNA的生成中起上游作用。
已知在miRNA生成过程中,TGH通过促进pri-miRNA - hyl1相互作用,促进DCL1作用和pri-miRNA加工。随后,作者测试了MTA的缺失以及MTA - tgh相互作用的丧失是否也会影响Microprocessor的组装。通过协同免疫定位,作者确定在tgh突变体DCL1与RNA Pol II的共定位显著降低。作者发现mta突变体中RNA Pol II对DCL1 coloc的降低水平类似(图5A和B)。HYL1 colocalization与RNA聚合酶II也减少了在mta突变体植物类似tgh突变体(图5C和D)。观察到TGH或MTA的缺失阻碍了RNA Pol II与DCL1和HYL1的共定位,这表明MTA通过MTA - TGH的直接相互作用吸引TGH或借助额外的m6A解读蛋白促进Microprocessor的组装。
图5 Microprocessor组装在mta和tgh突变体中均受损
6 MTA调节miR393b的水平,miR393b参与生长素应答
发现,当同时引入野生型和mta突变体背景时,生长素反应性DR5pro:GUS报告基因构建体就是这种情况。用2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)诱导14天大的幼苗后,MTA植物显示出的GUS表达要少得多(图6A)。
miR393b参与生长素应答调节,在缺乏miR393b的突变体中,生长素信号通路减少。在作者的sRNA测序数据中,作者发现miR393b在mta突变体中下调,尽管作者在m6A-IP Seq中无法检测到其前体。然而,由于m6A在调控生长素应答中的重要作用,作者进一步研究了m6A对miR393b 累积的需求。作者使用m6A-IP和RT-qPCR确认了pri-miR393b是m6a -甲基化。与MTA结合的IP RNA也证实了MTA与pri-miR393b的结合(图6B)。值得注意的是,作者的PIP-seq分析显示,pri-miR393b在mta中的结构比WT中的要少。
为了进一步证明miR393b的低表达水平实际上是由于缺乏MTA导致的,作者进行了瞬时表达分析。作者设计构建表达pri-miR393b MTA或ΔMTA。通过引物诱导的点突变制备ΔMTA,引起以下变化:催化DPPWmotif上482位的天冬氨酸变成丙氨酸(D482A),使该蛋白失去催化活性。将它们单独或组合地引入烟草叶片中。然后作者评估成熟miR393b水平。结果表明,在mta突变体植物中重新诱导的生长素应答部分是由miR393b生物发生调控缺陷引起的,该缺陷是由于缺乏mta活性。
图6 mta突变体中生长素的不敏感性与pri-miR393b的甲基化损失和成熟miR393b的低水平相关

讨论

在本文中,作者表明除了影响mRNA代谢,m6A甲基化也存在于pri-miRNAs中,并影响拟南芥的miRNA生物生成。作者发现,在至少25% miRNAs的情况下,较低水平的MTA会导致miRNA水平的降低,而pri-miRNAs往往会在突变植物中过度积累。由于MTA是已知的mRNA甲基转移酶,而m6A在mRNA中含量丰富,作者认为观察到的影响可能是间接的,可能是其他miRNA生物发生蛋白代谢改变的结果。作者使用了两种不同且独立的方法来排除这种可能性。分析结果表明,mta突变体中双链RNA结合蛋白HYL1与未甲基化pri-miRNAs的结合效率较低。作者的研究还表明,MTA可以直接与参与miRNA生物发生早期阶段的蛋白质TGH相互作用。基于作者的结果,作者提出了一个模型来显示MTA/m6A在植物miRNA生物发生中的变化。pri-miRNAs的m6A甲基化影响miRNA前体二级结构,从而刺激HYL1对pri-miRNAs的识别。MTA和TGH蛋白之间的直接相互作用,以及可能与TGH相互作用的未知m6A解读器对m6A标记的识别,可能也参与了HYL1对甲基化miRNA前体的招募。之前描述的TGH参与了HYL1对pri-miRNAs的招募,这有力地证明了这一点。因此,HYL1对pri-miRNA的识别以及整个活性Microprocessor的组装受pri-mRNA m6A甲基化控制,这会诱导前体的正确二级结构以及特定的MTA-TGH相互作用, 支持植物miRNA生物发生机制的高效组装。
图7 m6A/MTA在植物miRNA生物发生中的作用示意图

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