科研 | CELL REP：人冠状病毒侵入因子的单细胞RNA表达图谱
编译：不二，编辑：景行、江舜尧。
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为了预测人类冠状病毒的生物取向性，研究人员利用单细胞转录组学分析了28种SARS-CoV-2和冠状病毒相关受体因子（SCARF）。SCARF包括促进和限制病毒侵入的细胞因子。肠杯状细胞、肠上皮细胞和肾近端小管细胞对SARS-CoV-2表现出高度的耐受性，与临床数据一致。研究人员的分析还预测了肺部和脑部感染的非典型侵入途径。SARS-CoV-2似乎也可以感染精原细胞和前列腺内分泌细胞，这表明男性特有的脆弱性。前病毒因子和抗病毒因子在鼻上皮细胞内高度表达，具有潜在的年龄依赖性变异，表明冠状病毒感染的重要地点。研究人员的分析还表明早期胚胎和胎盘发育有中度感染风险。最后，SCARF的表达在一部分灵长类器官中表现出广泛的保守性。该研究为冠状病毒生物学和病理学的探索奠定了基础。
论文ID
原名：A Single-Cell RNA Expression Map of Human Coronavirus Entry Factors
译名：人冠状病毒侵入因子的单细胞RNA表达图谱
期刊：Cell Reports
IF：8.109
发表时间：2020年9月
通讯作者：Manvendra Singh，Vikas Bansal和Ce´ dric Feschotte
通讯作者单位：美国康奈尔大学
DOI号：10.1016/j.celrep.2020.108175
实验设计
结果
由于许多参与病毒复制的细胞因子，如参与转录、翻译和其他功能的细胞因子，不太可能影响病毒的取向性，因此研究人员主要关注在侵入水平上起作用的因子。人类细胞中两个已知的促进SARS-CoV-2（以及之前的SARS-CoV）侵入人体细胞的因子（图1）：ACE2（血管紧张素转换酶2）受体和TMPRSS2（跨膜丝氨酸蛋白酶2）蛋白酶。细胞表面蛋白Basignin（BSG）是SARS-CoV和SARS-CoV-2的受体，已得到实验支持。研究对象还包括已被实验证实可促进SARS-CoV/hCoV-229E（ANPEP、CD209和CLEC4G/M）或MERS-CoV（DPP4）侵入的受体，因此，它们是促进SARS-CoV-2侵入的候选受体。研究人员考虑了除TMPRSS2外的一些细胞蛋白酶作为可选择的启动因子。最近，TMPRSS4证明能够对人类细胞中的SARS-CoV-2发挥这一功能。TMPRSS11A/B证明能激活其他冠状病毒的S肽。此外，已知FURIN可激活MERS-CoV，并可能激活SARS-CoV-2，组织蛋白酶（CTSL/B）也可替代TMPRSS2激活SARS冠状病毒。重要的是，研究人员还收集了一些已知的限制因子（RF），这些因子可以保护细胞免受SARS-CoV-2（LY6E）或广泛的包膜RNA病毒（包括SARS-CoV（IFITM1-3））侵入细胞。研究人员还考虑了一些在侵入后但在病毒相对较早的复制中起作用的其他因素，如TOP3B和MADP1（ZCRB1），它们可能以组织/细胞类型特异的方式表达，已知分别对SARS-CoV-2和SARS-CoV基因组复制至关重要。最后，还包括了一组已知参与一系列RNA病毒组装和运输的蛋白质，并且最近被证明与SARS-CoV-2结构蛋白发生物理相互作用，包括Rho-GTPase复合物（RHOA、RAB10、RAB14和RAB1A）、AP2复合物（AP2A2和AP2M1）的成员。总的来说，研究对象包括28个可以调节SARS-CoV-2侵入和复制的候选因子（图1）。
图1. SARS-CoV-2和SCARF。SARS-CoV-2感染周期及其与侵入因子（细胞表面受体、蛋白酶和RF）和侵入后因子（复制和装配/运输因子）的细胞相互作用的插图。
2 着床前胚胎发育过程中SCARF的表达
为了分析SCARF的RNA在早期胚胎发育中的表达情况，研究人员挖掘了人类着床前胚胎的scRNA-seq数据。分析显示，在合子基因组激活（ZGA；8细胞期）之前，ACE2在发育的早期阶段最为丰富，表明母体RNA沉积（图2A）。在ZGA后，ACE2水平逐渐降低，直到营养外胚层（TE）形成，在此过程中它们再次升高（图2A）。相比之下，TMPRSS2表达只在TE细胞谱系中明显。事实上，在ZGA之前，没有一个TMPRSS家族成员表现出显著的转录水平（图2A）。多能干细胞显示IFITM1-3的高表达，但没有ACE2表达的证据（图2A）。此外，对另一个scRNA-seq数据集进行分析，约60000个细胞，这些细胞代表从多能干细胞体外分化的细胞类型，在分化后的20天内，任何细胞都没有明显的ACE2表达。总之，这些数据表明，多能干细胞和处于早期分化阶段的细胞不太可能被SARS-CoV-2感染。
3 母胎界面（MFI）的SCARF表达
TE中高水平的TMPRSS2、ACE2和其他冠状病毒受体（如ANPEP），以及该谱系中较低水平的IFITM（图2A），增加了发育中的胎盘易受SARS-CoV-2感染的可能性。为了探究这一点，研究人员研究了来自妊娠早期MFI收集的组织的约70000个单细胞的转录组，其中包括胚胎来源细胞（胎盘）、母体血液和蜕膜细胞。该数据集的分析涵盖了滋养细胞、蜕膜细胞和免疫细胞的主要类型（图2B）。ACE2和DPP4受体在细胞滋养层（CTB）和合胞滋养层（STB）中表达明显。ANPEP在所有胎儿谱系中都大量表达，而BSG在母体和胎儿细胞中广泛表达，但在胎儿细胞中密度较高（图2C和2D）。分析确定了CLEC4M基因是蜕膜血管周围细胞的一个强有力的标记（图2C）。有趣的是，绒毛外滋养层（EVT）显示ACE2或TMPRSS2水平较低，但RF的IFITM1-3和LY6E水平中等至较高水平，这些也由免疫细胞和蜕膜细胞表达。在任何细胞类型中，表达TMPRSS2的细胞都比那些表达受体的细胞数量少（图2C）。因此，母体-胎盘界面（MFI）显示出一种复杂的SCARF表达模式。
为了更精确地评估不同胎盘细胞类型对SARS-CoV-2侵入的允许性，研究人员量化了每种细胞类型与蛋白酶或RF共同表达不同受体组合的比例。CTB对各种受体-蛋白酶组合具有最大比例的双重阳性细胞，包括ACE2+TMPRSS2+（0.05%）、ACE2+FURIN+（~3%）、BSG+TMPRSS2+（0.8%）、BSG+FURIN+（10%）、DPP4+TMPRSS2+（0.6%）和DPP4+FURIN+（约10%）（图2D、2E）。血管周围组织也显示出BSG+TMPRSS2+和DPP4+TMPRSS2+细胞，尽管与CTB相比比例较小（0.5%）（图2E）。有趣的是，在整个数据集中，相当一部分DPP4+细胞（约20%–80%）共同表达IFITM1-3和LY6E，而ACE2+和BSG+细胞很少共同表达这些RF（图2E）。相反，ACE2+细胞倾向于共同表达TMPRSS2和FURIN，但这也主要局限于一小部分的CTB细胞（图2E）。总的来说，这些结果表明CTB是最易感染冠状病毒的细胞类型。
图2. SCARF在着床前胚胎和MFI中的表达。（A）着床前发育各阶段SCARF转录水平热图（n=20个卵母细胞和胚胎，124个单细胞）。（B）UMAP图显示了MFI中确定的细胞簇（n=22个供体，64054个单个细胞）。（C）MFI主要细胞类型的SCARF的RNA转录水平和密度。点颜色从蓝色到红色，分别对应较低和较高的表达。点的大小与特定细胞类型中表达该基因的细胞百分比成正比。*代表阳性细胞百分比的显著富集，使用单侧Fisher检验计算，并通过Bonferroni校正进行调整。（D）特征图显示了MFI的UMAP上表达ACE2、DPP4、BSG和ANPEP的细胞。根据表达水平对细胞进行染色，从浅蓝色（低表达）到红色（高表达）。（E）箱线图显示了MFI主要细胞类型中ACE2+TMPRSS2+、DPP4+TMPRSS2+和BSG+TMPRSS2+细胞的百分比。
4 生殖器官的SCARF表达
通过GTEx联盟研究的所有成人组织RNA-seq中，ACE2在人类睾丸中的表达水平最高。为了更精确地监测SCARF在男性和女性生殖器官中的表达情况，研究人员分析了两名健康捐赠者采集的睾丸样本和五名健康捐赠者的成年卵巢样本的scRNA-seq数据集。在成年睾丸中，研究人员能够重现原始已报道确定的细胞群，包括早期和晚期的精原细胞（SPG）、精原干细胞（SSC）、精子细胞（ST）、巨噬细胞、内皮细胞和免疫细胞，每个阶段都由一组独特的标记基因定义。关于SCARF，研究人员观察到TMPRSS2在早期和晚期SSC中都有强烈表达，而CoV受体在SSC的早期阶段大量表达（图3A），其中早期SSC中表达的一种受体（ACE2、BSG、DPP4或ANPEP）在整个睾丸数据集中与TMPRSS2持续共表达（图3B）。此外，与SARS-CoV-2蛋白相互作用并有助于病毒运输或组装的其他SCARF也显示在SSC和SPG中的转录水平最高（图3C）。相反，在精原细胞的四个簇中，RF的表达均较低（图3A）。总的来说，这些结果表明精原细胞对SARS-CoV-2感染具有高度的耐受性。
对来自5个捐赠者的卵巢皮质样本进行分析，确定了该组织的主要细胞类型，如粒层细胞、免疫细胞、内皮细胞、血管周围细胞和基质细胞，每种细胞都由一组独特的标记物定义。ACE2+细胞在这个数据集中通常很少见，在粒层细胞中最明显，它们显示每个细胞相对较高的表达水平（图3D）。在特定的卵巢细胞群中，可替代受体在显著表达。例如，DPP4在4%的内皮细胞中表达，而CLEC4M和BSG在粒层细胞中高度表达（图3D）。T细胞和内皮层细胞分别显著富集ANPEP和DPP4转录本（图3D）。然而，研究人员无法在整个卵巢数据集中识别出任何单个细胞有TMPRSS2表达或蛋白酶TMPRSS4、TMPRSS11A、TMPRSS11B的表达。这些蛋白酶似乎都不在卵巢组织中表达，而19个成员中在睾丸表达7个。研究人员观察到卵母细胞也缺乏来自TMPRSS家族成员的表达（图2A）。总的来说，这些数据揭示了男性和女性生殖器官之间的鲜明对比：虽然精子发生的早期阶段对SARS-CoV-2的侵入可能是非常允许的，但是卵巢和卵母细胞不太可能受到感染。
图3. SCARF在生殖器官中的表达。（A）SCARF在成年睾丸中的表达（n=26572个单个细胞）。（B）睾丸各主要细胞类型中不同受体蛋白酶组合的双阳性细胞的热图。（C）线箱图显示不同睾丸细胞类型SCARF的平均表达。（D）SCARF在成年卵巢中的表达（n=51216个单细胞）。
5 人类细胞图谱揭示了成人器官对SARS-CoV-2的潜在耐受性
研究人员分析了一部分人类细胞图谱（HCL）产生的约200000个细胞的scRNA-seq数据集，该数据集包括所有主要成人器官。研究人员选择了14个不同的成年组织，并将鉴定了33个不同的细胞类型，使用原始文章中的标记进行了注释（图4A）。
首先将分析重点放在ACE2和TMPRSS2上，这两个基因为SARS-CoV-2的侵入因子。这两个基因的转录本（占细胞总数的0.1%以上）主要在结肠、肠（回肠、十二指肠和空肠）、胆囊和肾脏细胞中检测到。研究人员在剩下的组织和细胞类型（图4B）中检测到ACE2和/或TMPRSS2几乎没有表达，包括肺泡1型（AT1）细胞和肺泡2型（AT2）细胞。即使在特定器官或细胞类型中检测到ACE2和/或TMPRSS2，只有在极少数细胞同时表达这两种基因。例如，肾脏中ACE2和TMPRSS2水平相对较高，但只有0.01%的细胞呈现双重阳性。在研究人员对ACE2和TMPRSS2（0.5%–5%双阳性细胞）共表达水平相对升高的分析中，只有三种细胞类型显著：肠细胞、近端小管细胞和杯状细胞（图4B和4C）。
对可替代受体的研究揭示了一个更复杂的结果，部分反映了这些基因的组织特异性。例如，如前所述，CLEC4G和CLEC4M在肝脏中高表达，具体在窦状内皮细胞和肝细胞中（图4B）。BSG是小脑的周细胞和星形胶质细胞以及肾脏的夹层细胞的标记基因，而CD209在巨噬细胞中富集（图4B）。ANPEP和DPP4在多个器官和细胞类型中共同表达，包括前列腺、肺、肾、结肠和小肠。前列腺显示DPP4高水平表达（TMPRSS2或FURIN双阳性约15%）和ANPEP中等水平表达（TMPRSS2或FURIN双阳性约5%）。在肺中，AT2细胞也显著表达DPP4、BSG和ANPEP，以及TMPRSS2和/或FURIN（图4B和4C），这表明这些受体，而不是ACE2，可能代表了SARS-CoV-2感染AT2细胞的初始通道，而在SARS和COVID-19病理学中被广泛破坏。肾脏的夹层细胞以及结肠的杯状细胞和肠上皮细胞也高度富集TMPRSS2+DPP4+BSG+（图4B、4C）。
小肠在本数据集中比较独特，表达高水平的ACE2、ANPEP和DPP4，空肠中的含量最高，并且显示高水平的TMPRS2。与最近的研究一致，研究人员发现这些因子在小肠中的大部分表达是由肠细胞及其祖细胞驱动的（图4A-4C）。只有另外两种细胞类型表达ACE2、ANPEP、DPP4和TMPRSS2较为显著：（1）杯状细胞，上皮细胞排列并产生粘液，包括十二指肠、回肠、结肠和胆囊；（2）肾脏的近端小管细胞（图4A-4C）。此外，肠细胞和杯状细胞富集与SARSCoV-2蛋白相互作用的SCARF，并参与病毒的运输或组装。
综上所述，冠状病毒侵入因子似乎在许多健康成人器官中表达，但在局限的细胞类型中，包括周细胞、星形胶质细胞、小脑小胶质细胞、肝窦内皮细胞、前列腺内分泌细胞、小肠上皮细胞、杯状细胞和肾近端小管细胞。
图4. SCARF在14个成人组织中的表达。（A）UMAP可将14个成人组织中约200000个单细胞分成33种不同的细胞类型。这些细胞类型由78个细胞簇合并而来，这些细胞簇是从最初的聚类中定义的。样本数量已在图中标出。（B）在图4A中定义的33种细胞类型中，SCARF的表达水平和密度。（C）33种细胞类型中不同受体蛋白酶组合的双阳性细胞的热图。
6 鼻上皮
鼻上皮被认为是SARS-CoV-2感染的主要途径。由于HCL数据集中未包含该组织，研究人员分析了另一个scRNA-seq数据集，该数据集来自三项独立研究。合并数据集的分析显示，在所有6个样本中有四个主要的细胞簇，分别对应于纤毛的、分泌的和基底上的上皮细胞以及自然杀伤细胞（图5A）。自然杀伤细胞主要表达DPP4，而三种上皮细胞类型显示低至中等水平的ACE2、ANPEP、BSG和TMPRSS2（图5A）。ACE2在纤毛细胞中最为丰富，而ANPEP在分泌细胞中表达最为丰富。相反，BSG在所有鼻上皮细胞类型中都很丰富，尽管基底上细胞的水平更高（图5A）。TMPRSS2在三种鼻上皮细胞中均有表达，其中纤毛细胞密度最高（41%）。与消化系统相比（图4B和4C），鼻上皮细胞很少显示ANPEP、DPP4和ACE2的共表达，而是这三种受体中的一种的唯一表达（图5A）。相比之下，RF的IFITM3和LY6E在所有三种鼻上皮细胞类型中都高表达（图5A），在分泌细胞和基底上细胞中表达水平最高。最后，研究人员计算了ACE2、TMPRSS2和RF的各种组合的二/三阳性细胞百分比。发现85%和65%的ACE2+TMPRSS2+纤毛细胞分别呈现LY6E和IFITM3阳性。总之，这些数据表明鼻上皮表达多种因子的组合，这些因子原则上可以促进SARS-CoV-2感染，但它也表达了大量的RF，也可能是该组织中一个强大的保护屏障。
7 年龄可能调节鼻上皮SCARF的表达
为了研究鼻上皮内CoV侵入因子表达的年龄效应，前面分析的三个样本来自相对年轻的捐赠者（24-30岁），而另外三个样本来自老年人（50-59岁）。虽然这是一个小样本，但可以将数据分为“年轻”和“老年”两组，并比较两组之间对侵入因子呈阳性的分泌细胞和纤毛细胞的百分比。两组间ACE2、TMPRSS2或TMPRSS4阳性细胞的百分比相当，且这些因子在两组的纤毛细胞中表达最高。然而，在纤毛细胞群和分泌细胞群中，老年组中双阳性细胞（ACE2+TMPRSS2+或ACE2+TMPRSS4+）的百分比明显较高（图5B）。ANPEP+TMPRSS2+/4+双阳性细胞的百分比显示出相反的趋势：它们在年轻组纤毛细胞和分泌细胞中明显更高（图5B）。为了检验这些差异是否是由鼻上皮内受体和/或蛋白酶的相对表达的年龄依赖性变化引起的，研究人员在每个年龄组和每个独立研究中对纤毛细胞和分泌细胞进行了整体差异基因表达分析。在所有三项研究中，与纤毛细胞相比，分泌细胞中ANPEP、TMPRSS4和CTSB显著上调，而与年龄无关（图5C）。相反，年轻组的纤毛细胞中TMPRSS2水平上调，但老年组的个体中TMPRSS2水平保持不变（图5C和5D）。这些结果表明，在年轻人鼻上皮分化过程中，TMPRSS2的调节发生了变化，而老年人则没有这种变化（图5C和5D）。
图5. 鼻上皮中SCARF的表达。（A）左图：UMAP显示了来自3个独立研究（n=18227个单个细胞）的6个鼻上皮scRNA-seq样本的细胞聚类。右图：显示了hCoV受体（ACE2、ANPEP和BSG）、蛋白酶（TMPRSS2、CTSB和TMPRSS4）和RF（LY6E和IFITM3）表达的特征图。（B）比较年轻组（n=3）和老年组（n=3）鼻上皮样本的纤毛细胞和分泌细胞中不同受体/蛋白酶组合的双阳性细胞百分比的柱状图。误差条表示平均值的标准误差。每个点代表一个单独的样本。数据用mean±SEM表示。（C）维恩图显示年轻组（n=3）和老年组（n=3）鼻上皮样本中纤毛细胞和分泌细胞之间共享和独特的差异表达基因（DEG）。上面板显示纤毛细胞中上调的基因，而下面板显示分泌细胞中上调的基因。（D）火山图显示纤毛细胞和分泌细胞之间的DEG，这三项研究中的每一项都是独立鉴定的。
8 灵长类动物SCARF表达的保守性
为了研究SCARF在灵长类动物中表达的进化保守性，研究人员分析了人类（n=4）、黑猩猩（n=4）和恒河猴（n=4）的心脏、肾脏、肝脏和肺的原始组织的比较转录组数据集（RNA-seq），共包含47个样本。如预期的那样，UMAP分析表明，样本首先按组织聚集，然后按物种聚集（图6A）。
总的来说，研究人员观察到大多数SCARF的组织特异性较低，种间保守性较高，但ACE2和DPP4受体明显例外，这两种受体在组织和物种间表达的差异最大（图6B）。具体而言，黑猩猩的肝脏和肺样本显示相对较高的DPP4表达，但ACE2表达相对较低（图6C和6D）。来自人类和黑猩猩的肝脏和肺样本不表达ACE2；然而，猕猴肝脏显示ACE2、DPP4、ANPEP和TMPRSS2基因的高表达水平（图6D）。这些结果表明，猕猴可能比人类或黑猩猩更容易感染肝脏冠状病毒。与研究人员对HCL数据集的scRNA-seq分析一致，研究人员发现ACE2、DPP4、ANPEP和TMPRSS2基因在所有三种灵长类动物的肾脏中的表达水平都高于其他三种器官。因此，在本分析中检查的四个器官中，肾脏似乎是最容易被冠状病毒感染的器官（图6C和6D）。
最后，研究人员分析了食蟹猴（恒河猴的近亲）胚泡中SCARF的表达模式，并与人类胚泡进行了比较（图2A）。有趣的是，这两个物种对一些侵入因子表现出不同的表达模式。TMPRRS2在人类TE中高度表达，但在猕猴囊胚中基本上无法检测到该基因的转录本，包括TE（图6E）。此外，与其他胚泡谱系相比，猕猴TE中的ANPEP下调，而在人类TE中则上调（图6E）。因此，人类和猕猴早期胚胎对冠状病毒感染的易感性可能存在显著差异。
图6. SCARF表达的跨物种分析。（A）基于在样本中表达变化最大的11929个同源参考基因，对来自三个物种（人类、黑猩猩和食蟹猴）的四个组织（心脏、肺、肝和肾）的47个RNA测序样本进行UMAP聚类。（B）47个样本中每个同源基因的标准化平均表达量（CPM）和离散度的散点图。每一点都对应于一个基因。样本中1987个可变基因用粉红色点表示。红色三角形表示SCARF。（C）显示每个组织ACE2和DPP4表达的小提琴图。每个点来自不同的样本。（D）按组织和物种分组的每个单独样本（n=47）的ACE2、TMPRSS2、ANPEP和DPP4的表达水平热图。（E）食蟹猴着床前囊胚中ACE2、TMPRSS2和ANPEP的表达的小提琴图。
讨论
虽然COVID-19主要是一种通过肺炎导致死亡的呼吸道疾病，但许多未知的组织和细胞类型对SARS-CoV-2的脆弱程度仍不清楚。宿主遗传因子如何与病毒相互作用，以及它们如何调节感染过程，也仍然不清楚。研究人员挖掘了大量公开的scRNA-seq数据，以及其他对SARS-CoV-2侵入健康组织中很重要的宿主因子的表达。由于这些因子的基本表达水平至少在一定程度上决定了病毒的取向性，因此，这些信息在预测哪些组织更容易感染方面是基础的。这些数据对于指导和优先考虑临床干预和病理研究，包括活检也很重要。最后，这种分析有可能揭示个体内部和之间可能的感染途径。
本研究与迄今为止报道的所有其他研究的不同之处在于，研究人员对大量组织进行了更广泛的研究。涵盖了大量的器官，主要取决于原始数据的公开可用性，并对数据集进行统一的标准化。例如，研究人员能够通过一个测序设备和平台整合HCL样品。此外，两个数据集（人体细胞图谱中的胎盘和鼻腔）之前在别处也进行过分析。
在这项研究中，研究人员检查了各种SCARF的表达谱。这些因子可能是2018年3月SARS-CoV-2的关键因子。事实上，冠状病毒具有抑制干扰素和其他免疫信号通路的多种机制，而且越来越多的证据表明，SARS-CoV-2感染也会引起“微弱”的干扰素反应。因此，RF在特定靶细胞中表达水平可能是病毒在感染开始时遇到的主要障碍。然而，仅仅从RNA水平很难推断这些RF的表达是否真的会使一个特定组织的病毒抵抗力趋于平衡。正如hCoV-OC43那样，一些冠状病毒甚至可能已经适应使用这些RF以发挥其优势。研究人员总结和讨论的结果将进一步促进对SARS-CoV-2生物向性和病理学的理解。
1 发育中的胚胎可能有感染的危险
在胚胎发育的早期阶段，包括多能干细胞，ACE2的mRNA水平都很低。它在培养的多能干细胞中保持沉默，即使20天后在体外分化成各种细胞类型也是如此。在呼吸道上皮中观察到ACE2表达与细胞分化水平呈正相关。
唯一具有大量ACE2表达的着床前细胞谱系是TE，其中TMPRSS2也高表达。在胚胎发育过程中，胚胎干细胞产生各种不同类型的滋养层（胎盘胎儿细胞）。因此，ACE2和TMPRSS2的表达至少持续到妊娠早期。研究人员发现少数CTB的ACE2、BSG和/或DPP4与TMPRSS2共表达，但IFITM和LY6E表达水平非常低。因此，一部分滋养层细胞可能允许SARS-CoV-2侵入。总的来说，研究结果与当前的临床数据一致，表明SARS-CoV-2从感染的母亲到胎儿的垂直传播是合理的，但可能很少见。未来的研究应着眼于检测妊娠不同阶段的SCARF表达，并评估SARS-CoV-2感染是否会危及妊娠。
2 卵巢细胞可能对SARS-CoV-2有抵抗力，但精原细胞似乎没有
虽然研究人员没有发现任何TMPRSS基因在女性生殖组织中表达的证据，但分析表明，精子发生的早期阶段易受SARS-CoV-2和其他冠状病毒的影响。事实上，研究人员观察到精原细胞（和干细胞）表达高水平的ACE2、TMPRSS2、DPP4和ANPEP，以及低水平的IFITM和LY6E。一项研究报告了精原细胞、支持细胞和间质细胞中ACE2的高水平表达，但没有对其他SCARF进行研究。虽然尚不清楚SARS-CoV-2或其他冠状病毒是否能渗透到睾丸，但值得注意的是，感染SARS-CoV的男性患者的死后尸检显示生殖细胞广泛破坏，生精小管中精子很少或没有，以及其他睾丸异常。这些结果揭示前列腺内分泌细胞对SARS-CoV-2也有抑制作用，因此需要对男性COVID-19患者的睾丸进行病理检查，并调查其生殖功能。
3 呼吸道：SARS-CoV-2如何感染肺细胞？
由于COVID-19和SARS主要是呼吸系统疾病，具有肺和呼吸道系统ACE2和TMPRSS2的表达，这两个SCARF被认为是SARS-CoV-2生物向性的主要决定因素。矛盾的是，作为一个整体，健康的肺组织只显示ACE2和TMPRSS2的中度表达。尽管如此，许多挖掘scRNA-seq数据的研究报告了在特定肺细胞群中ACE2和/或TMPRSS2的显著表达：AT2细胞。然而，最近的研究对这些观察结果提出了挑战。本研究结果与肺细胞（包括AT2细胞）的基础ACE2的RNA水平非常低的观点一致。综上所述，这些数据提出了一个问题：ACE2是否是SARS-CoV-2引发肺部感染的主要受体。一个解释是，由于遗传或环境因素，ACE2在肺中的表达是广泛变化的。越来越多的证据表明ACE2可以由干扰素和其他先天免疫信号诱导。
4 中枢神经系统与心脏：临床症状是否表现为CoV-2感染？
一些COVID-19患者表现出神经学症状，如脑炎、中风、癫痫发作和嗅觉丧失，但尚不清楚SARS-CoV-2是否能主动感染中枢神经系统。在一例确诊为脑炎的病例中，在脑脊液中检测到SARS-CoV-2 RNA。一些研究报告了ACE2在不同脑细胞中的表达。研究人员发现受体BSG在周细胞和星形胶质细胞中大量表达，但在这些细胞类型中，TMPRSS2/4没有表达。然而，在这些细胞中，FURIN和CTSB蛋白酶通常与BSG共同表达，这暗示了病毒侵入这些细胞类型的潜在途径。由于周细胞位于血脑屏障附近，这些细胞可能成为中枢神经系统感染的通道。
SARS-CoV-2是否会感染心脏是另一个悬而未决的问题。据报道，大部分COVID-19患者存在严重的心脏损害和异常凝血。研究人员发现，ACE2在心肌细胞中表达，但同一细胞群似乎不表达TMPRSS2/4，因此仍不清楚病毒如何渗入心肌细胞。尽管如此，研究人员观察到FURIN与ACE2在很小比例（<0.1%）的心肌细胞中共表达。虽然目前尚不清楚SARS-CoV-2是否能利用FURIN引发感染，但研究人员的发现提示了一种可能的心脏感染途径。
5 鼻上皮：微生态环境还是主要地点？
最近，已有研究表明SARS-CoV-2侵入因子在鼻上皮的分泌细胞和纤毛细胞中高度表达。研究人员发现纤毛细胞中ACE2+或TMPRSS2+细胞的百分比高于分泌细胞或基底上细胞。相反，研究人员发现分泌细胞或基底上细胞中ANPEP+细胞的百分比高于纤毛细胞，而BSG在整个鼻上皮中广泛表达。研究人员还注意到19%的基底上细胞表达TMPRSS2。然而，ACE2+TMPRSS2+细胞在整个鼻上皮细胞中的百分比仍然很低，而IFITM3和LY6E在整个组织中显示出较高的RNA水平。总之，这些观察结果表明鼻上皮是SARS-CoV-2感染的主要地点，其结果可能对COVID-19的病理发展至关重要。
很明显，COVID-19在高龄患者中会引起更严重的并发症。一项研究报告称， TMPRSS2在人类肺组织中的表达水平随着年龄的增长而略有下降。研究人员发现ACE2和TMPRSS2/4本身在青年组和老年组鼻上皮中都没有差异表达，但研究人员观察到老年组鼻腔上皮细胞中ACE2+TMPRSS2+/4+双阳性细胞的百分比在老年人中更高，无论是纤毛细胞还是分泌细胞。相反，在年轻捐献者中，ANPEP+TMPRSS2+/4+细胞的百分比明显较高。老年人和青年人对SARS-CoV和SARS-CoV-2的相反易感性可能与这两种密切相关的冠状病毒对ANPEP和ACE2受体的不同使用有关。然而，研究人员的分析受限于小样本量和许多可能的混杂因素，如性别、吸烟状况和其他遗传和环境因素，这些因素无法控制。
6 消化系统：感染热点？
与几项研究一致，研究人员发现小肠是TMPRSS2与ACE2共表达的“热点”组织之一，但正如之前报道的DPP4和ANPEP也是如此。在小肠内，研究人员发现空肠是这些因子表达最高的地方。这与另一项研究结果略有偏差。他认为回肠中ACE2的表达量最高。无论小肠的哪一部分，这两项研究都一致认为，这些因子的表达在很大程度上是由肠细胞及其祖细胞驱动的，肠细胞和祖细胞排列在肠内表面，因此直接接触食物和病原体。
杯状细胞是另一种常见于消化系统的细胞类型，研究人员也预测这种细胞允许SARSCoV-2侵入。这些是在呼吸道、肠和结肠中发现的专门用于黏膜分泌的上皮细胞。研究人员发现杯状细胞与一个或多个受体（包括ACE2、ANPEP、DPP4和CD147/BSG）具有高水平的共表达。鼻上皮内的杯状细胞对SARS-CoV-2具有潜在脆弱性。总的来说，研究人员对消化系统的分析与其他几项研究一致，这些研究指出胃肠道内壁是SARS-CoV-2感染的常见部位。这可以解释COVID-19病例出现的消化系统症状（如腹泻），以及粪便中病毒脱落的检测结果。如果是这样的话，SARS-CoV-2的粪口传播可能是合理的，但仍有待于进一步严格的研究。
7 预测人细胞中冠状病毒的生物向性
虽然研究人员的大部分讨论集中在SARS-CoV-2上，但结果也为探索其他人类冠状病毒（包括SARS-CoV、MERSCoV、hCoV-229E和hCoV-NL63）的生物向性提供了宝贵的资源（表1）。例如，CLEC4G/M是介导SARS-CoV感染肝窦细胞的潜在候选药物。研究人员发现胎盘、睾丸、肠和肾脏的特定细胞类型共同表达ACE2、ANPEP和DPP4，因此似乎允许多种其他人类冠状病毒侵入，如SARS-CoV、MERS-CoV、hCoV-229E和hCoV-NL63（表1）。肺部的AT2和Clara细胞对MERS-CoV尤其敏感，而鼻上皮的分泌细胞可能易受hCoV-229E感染（表1）。虽然已知hCoV-NL63使用ACE2作为受体，但该病毒可能不依赖于与SARS-CoV/CoV-2相似的蛋白酶来激活。因此，研究人员对分析预测hCoV-NL63的生物向性缺乏信心（表1）。最后，一些其他人类冠状病毒（如hCoV-OC43和hCoV-HKU1）的生物向性在本研究中无法评估，因为它们的侵入依赖于宿主编码肽的翻译后修饰。
表1. 人类冠状病毒生物向性的预测
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