科研 | 河南农业大学：西瓜黄皮形成的转录组分析及性状基因的染色体定位（国人作品）
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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西瓜（Citrullus lanatus）二倍体含22条染色体，基因组~425Mb。叶绿素和类胡萝卜素是影响西瓜着色的主要因素。叶绿素的生物合成：氨基乙酰丙酸（ALA）→原卟啉→叶绿素a→叶绿素a/b的相互转换→叶绿素a的降解；类胡萝卜素的生物合成：牻牛儿牻牛儿焦磷酸（GGPP）→茄红素→番茄红素/胡萝卜素/叶黄素。研究发现调控西瓜黄皮形成的基因包括go（隐性遗传）、Clyr（显性遗传）。本试验对黄皮自交系WT4和绿皮自交系WM102进行转录组比较，对F2代分离群体进行分离群体分析（BSA-seq）和连锁遗传分析，揭示了西瓜黄皮形成的分子机制。
论文ID
原名：Comparative Transcriptome Analysis Provides Insights Into Yellow Rind Formation and Preliminary Mapping of the Clyr (Yellow Rind) Gene in Watermelon
译名：西瓜黄皮形成的转录组分析及性状基因的染色体定位
期刊：Frontiers in Plant Science
IF：4.106
发表时间：2020.03
通讯作者：杨路明
通讯作者单位：河南农业大学园艺学院
DOI号：10.3389/fpls.2020.00192
实验设计
① 植物材料。西瓜绿皮自交系WM102及黄皮自交系WT4，杂交产生F1和F2群体。卡方检验分析F2群体分离率（图1）。
② 叶绿素/类胡萝卜素测定。1g果皮与丙酮：酒精（1:1）混合提取，于分光光度计663.2/646.8/470nm读取吸光度。
③ RNA-seq。构建240bp cDNA文库，Illumina Hiseq2000双末端测序。TopHat进行参考序列比对，DESeq2筛选差异表达基因（DEGs），GOseq/KOBAS富集分析。RT-qPCR进行验证分析。
④ BSA-seq。根据F2群体的分离性状构建两个等量混合的DNA库，在Illumina HiSeq 2500测序。BWA进行参考序列比对，GATK与samtools预测SNPs，筛选差异较高的SNPs。
结果
1、果皮中的叶绿素和类胡萝卜素含量
为研究不同果皮中叶绿素含量和类胡萝卜素含量的差异，作者在某一相同发育阶段进行含量测定。叶绿素a和叶绿素b含量在黄皮中显著较低，而类胡萝卜素含量显著较高，且绿皮中的类胡萝卜素几乎为0（图2）。表明黄皮的形成与类胡萝卜素增加有关。
2、转录组分析
为探讨绿皮品种和黄皮品种的转录水平差异，同时对各品种的3个发育阶段进行比较，共构建18个cDNA文库。对两种果色西瓜及其3个发育阶段的果皮进行RNA-seq，每个文库的reads从5.96Gb至7.98Gb，参考基因组比对率78.31%-95.83%。西瓜参考基因组共23440个注释基因，但转录组共鉴定出24805个基因。其中1365个未知功能的基因通过Nr、SwissProt、GO、Pfam、KEGG做进一步注释，结果发现多数未知功能的基因的功能与复制/同源重组/DNA修复、转录、翻译、防御机制、胞外结构有关（图3）。主成分分析表明在发育不同阶段、及果皮的颜色均对转录本有所影响（图4）。
3、差异基因DEGs筛选与富集分析
对比黄皮与绿皮的转录本，在第一发育阶段，两种自交系的果皮均显绿色，共筛选581个DEGs，其中302个上调基因，279个下调基因（图5A）；在第二发育阶段，黄皮自交系开始显现黄色，共筛选396个DEGs，其中142个上调基因，254个下调基因（图5B）；在第三发育阶段，黄皮自交系显金黄色，绿皮自交系显深绿色，共筛选1385个DEGs，其中873个上调基因，512个下调基因（图5C）。考虑到黄皮自交系在不同发育阶段有较明显的颜色变化，故对比黄皮在不同发育阶段的转录本，对比第一和第二发育阶段，共获得4010个DEGs上调基因2069个，下调基因1941个（图5D）；对比第一和第三发育阶段，共有5760个DEGs，3063个基因表达上调，2697个基因表达下调（图5E）。可看出，DEGs的数目在不同发育阶段的比较是明显较多。此外，这5种对比产生的DEGs仅有有6个是共有的，而第一/二发育阶段共有47个，第二/三发育阶段共有142个，第一/三发育阶段共有92个（图6），表明果实的发育与着色受一组共同的基因调控。
K-means聚类分析表明黄皮西瓜三个发育阶段的DEGs存在9种表达模式，其中聚类基因数目最多的为第8组（图7）。对DEGs进行KEGG富集如图8所示，在第一发育阶段基因富集在植物激素信号转导和苯丙素的生物合成（图8A），第二发育阶段为碳代谢、乙醛酸和二羧酸盐代谢、光合作用、碳固定（图8B），第三发育阶段为苯丙素生物合成、花青素沉积、黄酮生物合成（图8C）。此外，获得了与叶绿素代谢相关的56个DEGs和与类胡萝卜素代谢相关的9个DEGs（图9）。其中，Cla013942编码光系统Ⅱ蛋白，Cla008566编码镁鳌合酶d亚基。这些DEGs的RT-qPCR验证与RNA-seq有较强的相关性（R2=0.9558）（图10）。
4、黄皮形成基因Clyr的定位
本试验获得F2分离群体1106株，其中黄皮818株，绿皮288株，说明黄皮性状受显性基因控制。随机选择30株性状明显的植株混合其DNA，进行NGS测序。共筛选到111074个SNPs，且显著差异的区域位于4号染色体的4.63-7.77Mb区域（图11A&B）。选择该区域的6个SSR/InDel多态性位点对F2群体进行基因分型，表明Clyr基因定位于引物InDel590358至4号染色体末端（图11C）。然而该定位区域含有3个注释基因，且在黄皮和绿皮西瓜中的表达无显著差异（图12）。
讨论
果皮颜色影响果蔬类作物的商品价值，黄皮西瓜因其外观美观，类胡萝卜素含量较高，营养价值高，广受市场欢迎。叶绿素和类胡萝卜素是影响果实颜色的重要因素，而颜色变化一般从深绿色至金黄色。在黄皮西瓜中，类胡萝卜素含量增加而叶绿素a和b明显减少。作者利用RNA-seq技术研究黄皮西瓜颜色形成过程的关键代谢途径，在3个发育阶段各得到581/396/1385个差异表达基因。富集分析发现DEGs参与叶绿体膜合成、植物激素信号转导、光合作用、碳固定途径，研究表明这些代谢途径在苹果、拟南芥中影响颜色形成。
大多数葫芦科植物的果实颜色是由一个显色/隐性基因控制，先前研究尝试把黄皮基因定位到一个59.8Kb区间，但未发现靶基因。本研究结合集群分离分析和二代测序将黄皮基因Clyr定位到4号染色体4.63-7.77Mb区域，包含三个注释基因，分别编码DNA糖基化酶、含AAA结构域的ATP酶、DNA结合蛋白。镁鳌合酶反应是叶绿素生物合成的重要步骤，需要水解ATP催化镁离子插入原卟啉，AAA结构域则决定了ATP酶依赖镁离子进行催化的。研究表明抑制AAA结构域ATP酶的表达会抑制烟草生长发育，是烟叶变黄。故可以推测本研究得到的染色体定位可能是黄皮基因，但奇怪的是本试验的黄皮和绿皮自交系中，这三个基因的表达不存在显著差异，故该区域不能认定为性状基因。重测序结果也证明两种性状的株系在该染色体区域没有发生变异。先前的GWAS研究筛选了西瓜4、6、8号染色体的3个与果皮颜色相关的候选性状基因，其中8号染色体的Dgo基因编码参与叶绿素合成的镁鳌合酶H亚基，故该基因与黄皮性状的形成的关系有待研究。
本研究确定了西瓜的黄色果皮与色素含量变化有关，发现不同果皮颜色的西瓜及其不同发育阶段均有差异表达基因，同时显示了果皮颜色的形成受不同代谢途径的基因的不同表达模式调控。BSA方法将Clyr基因定位到了4号染色体上端，但其中的3个基因均不是目的基因，因此黄皮性状基因仍有待研究。由于黄皮基因可能受其它调控因子的影响，如甲基化修饰等。故未来需要深入研究基因的更精密定位，或对定位区域内的基因和非编码蛋白转录本的功能研究。
评论
西瓜果实的果皮颜色影响其商品价值，本研究通过比较转录组学系统研究了影响黄皮形成的相关基因，并将黄皮性状基因Clyr定位在4号染色体上端。这些试验结果有助于揭示黄皮性状形成的关键基因，但其具体的性状基因及其调控机制仍有待研究。
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