编译：刘娟，编辑：十九、江舜尧。
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导读
肝脏疾病是一个主要的全球性卫生保健问题，影响着全世界约8.44亿人。其治疗选择仍然有限，部分原因是缺乏详细的技术来确定驱动人类这些疾病的细胞学和分子学机制。单细胞转录技术正在改变研究者对健康和疾病中细胞多样性和功能的理解。在这篇综述中，研究者将讨论这些单细胞技术在肝脏学中的应用，促进研究者对细胞异质性的理解，并为基本肝脏生物学提供新的见解，如肝细胞、内皮细胞和肝星状细胞的代谢和分化以及支持肝脏再生的细胞机制。 原名：Single-cell technologies in hepatology: new insights into liver biology and disease pathogenesis
译名：肝脏学中的单细胞技术:肝脏生物学和疾病发病机理的新见解
期刊：Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology
IF: 23.57
发表时间：2020年6月1日
通讯作者：Neil C.Henderson
通讯作者单位：University of Edinburgh, Ediburgh,UK
DOI号：10.1038/s41575-020-0304-x
肝病给全球卫生保健带来负担，数据表明全世界约有8.44亿人患有慢性肝病，每年有200万人死亡。探索治疗慢性肝病患者有效的方案会有助于减少发病率和死亡率。单细胞基因组学方法正在改变研究者对疾病发病机理的理解。在过去的几年中，单细胞基因组学领域的发展迅速，主要是因为这些方法能够在单细胞分辨率下对细胞状态和类型进行有力的和无偏倚的探索，从而对组织生物学和疾病机制产生了意想不到的新见解。这些新技术的应用现在成为了诸如人类细胞ATLAS等全球项目的基石，该项目旨在为所有人类细胞提供一个参考图，以大大提高研究者对人类健康和疾病的理解。肝脏病学领域也接受这些新方法, 过去3年发表了大量的肝单细胞RNA测序(scRNAseq)工作。在设计单细胞测序实验和工作流程时，必须考虑许多重要的因素(图1)。从scRNAseq实验中积累的信息还需要大量的生物信息学支持和分析。
1.肝脏上皮细胞生物学
肝内两种主要的上皮细胞类型是肝细胞和胆管细胞。肝细胞是肝脏的主要组成部分，具有多种功能，包括蛋白质合成、解毒、胆汁生成以及碳水化合物和脂质代谢。胆管细胞是胆管上皮细胞，排列在胆管内，促进胆汁的分泌和排泄。ScRNAseq分析为肝脏上皮细胞的生物学和功能提供了一些新的见解(表1)。
表1.单细胞技术在肝上的应用
1.1.肝脏细胞的区带
肝细胞功能区带在代谢和生物异质性上具有差异，其原因主要是氧的浓度梯度，营养物质和WNT信号穿过肝小叶（图2）。然而，在scRNAseq出现之前，还不可能对个体的肝脏细胞区带进行全面的定义。Halpern和同事利用scRNAseq结合单分子荧光原位杂交来定义小鼠肝细胞的异质性，使肝细胞亚群的空间定位成为可能。这项精细的研究解剖了小鼠肝小叶上的肝细胞区带的分子模式，显示了比以前更大程度的肝细胞区域，还有一半有待于进行区带划分的肝脏基因表达。重要的是，肝细胞基因在小叶中的表达为其他肝脏细胞系如肝窦内皮细胞(LSECs)的区域分布研究提供了框架，也为人类肝脏肝细胞区域分布研究提供依据。Aizarani等人对人肝细胞进行了scRNAseq和伪空间轨迹分析，以使其穿过肝小叶，显示出与在小鼠中观察到的区域基因相似的模式。对区带里的基因信号通路富集分析表明，门周肝细胞富集了负责氧化和脂肪酸代谢的基因，而肝中带的肝细胞富集了细胞色素P450异种代谢基因。总的来说，使用scRNAseq已经为研究人类和小鼠肝小叶不同区域的肝细胞的功能特性提供了许多新的见解，并有助于更深入地理解肝细胞区带是如何构造和调控的。
图2. 肝窦的细胞区带
1.2.肝脏发育和类器官
多谱系类器官细胞培养系统越来越多地应用于模型的建立和疾病的诊断，为研究新的治疗靶点提供了一个易于操作的平台。ScRNAseq已被用于探索三维培养系统如何影响细胞的识别和分化。scRNAseq分析了iPSC肝内皮层细胞培养与内皮细胞和间充质细胞3D多细胞类器官，展示了巨大的转录差异，包括肝细胞的分化,表达不同的基因参与细胞基质粘附,糖酵解、缺氧和细胞信号。为了确定哪种iPSC培养体系能更好地再现体内肝细胞的表型，研究者还对来自原代胎儿和成人肝脏的细胞进行了scRNAseq实验。胎儿肝细胞和成人肝细胞表现出许多转录差异，ipsc来源的肝细胞样细胞与原代胎儿肝细胞更接近。严格意义上说，在2D肝细胞分化方案的任何阶段，从3D多细胞肝芽培养中获得的ipsc来源的类肝细胞比ipsc来源的细胞更类似于原代胎儿肝细胞，肝芽培养的内皮细胞和间充质细胞也与胎儿相似。对肝芽培养中各细胞系之间配体受体相互作用的研究突出了不同细胞类型之间广泛的相互作用，并确定了特定通路的重要性，如VEGFA－VEGFR2在调节肝细胞差异中的作用。因此，scRNAseq已经分析了3D iPSC肝多细胞类器官培养中存在的谱系间相互作用，使得与单独iPSC培养相比，能够更准确和全面地再现人类肝发生的转录组方面。
1.3.肝脏再生和干细胞
肝脏具有显著的再生和修复能力，而肝细胞补充以自我更新是肝实质的来源这一观点在科学界有不同的争论。MacParland等人利用scRNAseq研究了人肝脏中的肝细胞异质性，区分了甲胎蛋白(AFP)阳性和AFP阴性的肝细胞，并观察到AFP阳性的肝细胞在参与细胞分裂和IL-6信号通路中富集。值得注意的是，AFP阳性和AFP阴性的肝细胞分布在所有三个肝小叶带的异形肝细胞中，提示肝再生能力的泛小叶模型类似于小鼠中报道的端粒酶高的肝细胞。同样的，Aizarani等人也检测到AFP阳性的人肝细胞的一个小亚群。利用蛋白质组学、细胞表面标记检测、miRNA和表观遗传学分析等方法进一步验证这些细胞代表了增殖亚群，加深了对肝脏再生的机制理解。在人肝脏中基于scRNAseq的研究证实了胆管细胞表达上皮细胞粘附分子(EpCAM);然而，在EpCAM+区间也观察到额外的异质性。进一步分析发现EpCAM+细胞包括成熟的胆管细胞、肝细胞偏置群体(ASGR1+)和幼稚祖细胞群体。为了评估在TROP2int祖细胞群中的功能，研究者在类器官中分离并培养了TROP2int细胞。这些祖细胞具有最高的器官形成能力，TROP2low或TROP2细胞没有形成任何器官，而TROP2high细胞形成的器官较少且较小。ScRNAseq还揭示了小鼠肝脏EpCAM+细胞间室的功能异基因性。在未损伤的肝脏中，大量EpCAM+细胞被富集为YAP的基因靶标，Hippo信号通路的下游传感器。胆道损伤后，YAP信号在胆管细胞和少量门周细胞中也呈上升趋势。
2.肝脏炎症和免疫
肝脏是免疫器官，含有大量先天免疫细胞和适应性免疫细胞。在健康方面，这些细胞在维持局部组织稳态和系统免疫方面发挥着重要作用。在肝脏疾病的背景下，肝免疫细胞已被证明调节包括纤维形成和癌变在内的重要病理过程。然而，免疫系统既复杂又多样，很难确定哪些特定的基因介导了特定的功能效应。单细胞技术有可能彻底改变研究者对免疫细胞在各种背景下的异质性和功能的理解。
2.1.单核吞噬细胞系统
单核吞噬细胞系统(MPS)一词最早建立于20世纪70年代，包括单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DCs)。当时的普遍观点是，循环中的单核细胞是组织中的巨噬细胞和树突状细胞的前体群。然而，一些研究清楚地表明，在不同器官中的组织宿主巨噬细胞是一个个体遗传学上截然不同的群体，来自胚胎前体细胞，能够独立于循环单核细胞自我更新。事实上，胚胎起源和自我更新已经被许多谱系追踪方法用于小鼠肝内巨噬细胞。同样，树突状细胞也可以起源于不同的造血前体，独立于循环中的单核细胞。因此，在个体发生和功能的基础上对这些种群进行了重新分类。肝脏受到炎症刺激后,循环单核细胞被招募到炎症组织和分化成单核细胞起源的巨噬细胞,单细胞方法对于充分了解肝组织中MPS的多样性和功能至关重要。
2.2.Kupffer 细胞
在体内平衡中，主要的肝巨噬细胞包括Kupffer 细胞，它位于肝血中，清除肠道源性病原体和受损的红细胞，调节铁和脂质代谢，维持免疫耐受，感知组织损伤(图3)。然而，由于缺乏已知的人类Kupffer细胞标记物，Kupffer细胞的这些功能特征在很大程度上是使用小鼠模型来定义的，而对Kupffer细胞的特征或定义有限。三个独立的人肝脏scRNAseq研究均发现人Kupffer细胞为CD163+MARCO+CD5L+TIMD4+巨噬细胞的突变。重要的是，对人Kupffer细胞独特标记的鉴定首次促进了这些细胞在人肝脏中的空间定位和证明了人Kupffer细胞的抗炎表型。对scRNAseq数据进行无偏倚的跨物种比较表明，人类和小鼠Kupffer细胞具有高度保守的转录谱。单细胞转录组分析结合Kupffer细胞特异性转录因子(Clec4f-Cre)敲除小鼠已经确定NR1H3和ZEB2是Kupffer细胞分化和维持的关键转录调节因子。应用基因调控网络重构scRNAseq数据也证实了NR1H3转录因子在人Kupffer细胞中的活性增加。人类Kupffer细胞是否也来自胚胎，并通过自我更新来维持仍有待确定。
2.3.单核细胞来源的巨噬细胞
肝脏中也有不同的巨噬细胞群，这些巨噬细胞来自于循环单核细胞的募集和分化。这些单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）同样具有重要的功能作用，例如可能有助于红细胞处理和铁的回收。一个无偏倚的scRNAseq方法揭示MDM异质性和函数,识别不同的分组TREM2+CD9+MNDA+伤口愈合相关的巨噬细胞(SAMacs),哪些在人类肝脏纤维化,扩张空间的局部地区疤痕，促进肝星状细胞(HSC)胶原蛋白生产和扩散。利用抗体标记技术将scRNAseq与高维蛋白表达数据相结合，将可能为这些关键细胞提供重要的免疫表型信息，并进一步提供分离巨噬细胞亚群进行功能分析的分类策略。值得注意的是，小鼠损伤相关的大型噬菌体在区分标记基因和人类SAMacs观察到的标记基因方面显示了大量重叠，其中TREM2和CD9在物种间保守。事实上，使用典型相关性分析对scRNAseq数据进行无偏倚的跨物种映射，已经证实人类和小鼠SAMacs代表了必然的种群，突出表明了scRNAseq方法在定义可用于治疗的核心损伤群体方面的效用。重要的是，在小鼠身上的scRNAseq数据也表明，西方饮食(高脂肪、高糖、高胆固醇)可诱导骨髓细胞亚群的改变，提示在肝脏损伤时系统单核吞噬细胞反应的重新编程。在肝病患者中应用类似的方法将有助于评估在人类中是否存在类似的机制。使用scRNAseq识别不同的人SAMac以提高研究者对肝脏疾病细胞功能的理解。轨迹推断或伪时间排序方法将单个细胞沿连续路径排列，以帮助加深研究者对细胞分化途径的理解。这些方法可以辅以RNA速度分析，以评估每个单细胞内剪接与未剪接的mRNA分子的比率，从而推断细胞的命运并将分化途径的方向性归之。血统追踪人类肝脏的单核吞噬细胞首次证实人类循环中SAMacs 来自招募和分化。使用scRNAseq对人肝巨噬细胞亚群的定义也使得表型差异细胞类型的基因表达标记得以生成。这些特征可以应用到反褶积算法中，促进了对已经过大容量转录前归档的整个组织活检样本的细胞类型组成的评估。使用这种方法可以利用公开的数据，评估不同疾病分期的更大组患者细胞成分的变化，而这些应用目前在scRNAseq中是不实际的。
2.4.树突细胞
肝脏还包含树突状细胞亚群，这是抗原呈递先天免疫的关键群体。单细胞方法已经改变了研究者对人类异质性的理解。DCs可以细分为两个单独的谱系。浆细胞样DC能够快速产生1型干扰素并调节炎症反应，而传统的DC(cDCs)是最特化的抗原呈递细胞并调节T细胞反应。事实上，cDCs还可以进一步细分为第1型cDC1和第2型cDC2。两种cDC亚群都能刺激CD4+ T细胞应答，而cDC1细胞更能刺激CD8+ T细胞应答。使用scRNAseq已经在human和mouse的肝脏组织中鉴定出了这三个DC群体，并有LILRA4、XCR1和CD1C等标记可用于区分它们。未来的工作应该着眼于区分这些人群在调节肝脏免疫方面的功能差异，并确定它们在肝病发病机制中的作用。
2.5.淋巴系统
2.5.1 T细胞
全身的适应性免疫反应是由T细胞协调的，长期以来，人们已经知道，肝驻留的T细胞室不同于观察到的外周循环。在已发表的人类肝脏scRNAseq数据中发现了肝内T细胞亚群，这些亚群在转录上与循环T细胞截然不同。由于T细胞转录活性低和基于液滴的scRNAseq工作流的读取深度较浅，从scRNAseq数据中分析T细胞亚群具有挑战性。然而，在所有的研究中，肝脏T细胞的明显异质性已经被证明，CD4+记忆T细胞、CD8+效应T细胞和阻断T细胞的不同集群被描述。在肝硬化患者肝脏中观察到T细胞表型的改变，随SELL+CCR7+CD4+ memory T细胞数量的增加。此外，从人类HCC样本中提取的T细胞中发现了大量耗尽的CD8+ T细胞和CTLA4hi调控性T细胞，两者都与抗肿瘤免疫受损有关。Layilin (LAYN)的表达是特异性的，HCC相关的T细胞，与不良临床结果相关，并抑制CD8+ T细胞IFN细胞的生成，提示LAYN的促肿瘤作用。通过使用scRNAseq对肝癌和肝内胆管癌(iCCA)的细胞组成进行研究，研究者进一步了解了肿瘤内T细胞的异质性。在高、低多样性肿瘤中，T细胞组成发生显著变化;低多样性的肿瘤T细胞被富集了细胞毒性和免疫检查点分子，而高多样性的肿瘤包含了更多的调节性T细胞。重要的是，肿瘤多样性高的患者预后更差，这表明免疫治疗方法可能对某些HCC和iCCA患者有效。应用scRNAseq研究T细胞还可以分析T细胞受体库，定义T细胞亚群的起源、克隆性和潜在的抗原特异性。该方法在HCC样本的初步应用证实了肿瘤微环境中耗尽的CD8+ T细胞和调节性T细胞的克隆扩增，使研究者能够更深入地分析T细胞的分化途径和命运。采用高通量方法对转录组、T细胞受体和抗原特异性的单细胞T细胞进行整合分析，将为T细胞在肝癌和其他炎症性肝病中的功能和治疗提供新的见解。
2.5.2先天淋巴细胞和自然杀伤细胞
先天淋巴样细胞(ILCs)是先天免疫系统中一个独特的分支，具有调节免疫、炎症反应和组织稳态等多种功能。根据细胞因子分泌模式和驱动其成熟的转录因子，ILCs被分为自然杀伤(NK)细胞、ILC1、ILC2、ILC3和淋巴组织诱导细胞。单细胞转录组学已被用于研究人类扁桃体中的ILC异质性，显示出每个主要ILC亚群之间的明显转录差异。在肝脏中，ILC亚群已经在人和小鼠中被确认。NK细胞与肝损伤和纤维化的发病机制有关，使用scRNAseq在纤维化的人肝组织中观察到CD56+CD16 NK细胞亚群的丢失。此外，在人HCC中观察到NK细胞成分的改变，观察到NK细胞与肿瘤富集的LAMP3+迁移cDCs亚群之间可能存在相互作用。这些数据强调了在复杂微环境中不同细胞类型之间的潜在分子相互作用中scRNAseq的作用。在小鼠模型中，其他的ILC亚群也被证明可以调节肝脏炎症。未来的工作将可能集中于在肝病背景下对人类ILCs的功能分析。
2.6.B细胞
B细胞产生抗体和抗原。在小鼠CCl4和MDR2高频肝损伤模型中，肝B细胞被证明调节肝纤维和致癌物。此外，B细胞功能的改变与慢性肝病患者对感染的抵抗力增强有关。对人肝脏鉴别不同群体的组织固定B细胞和浆细胞(产生大量抗体的终末分化B细胞)进行无偏倚的scRNAseq研究。然而，慢性肝病患者的肝B细胞的转录谱和位置没有观察到重大变化。在未来，将scRNAseq与B细胞受体基因分析结合，可能有助于提高对肝脏疾病中的B细胞和抗体克隆及功能的新认识。
图4. 人内皮细胞异质性
3.肝脏内皮细胞生物学
虽然先前可以使用细胞表面标记对肝脏内皮细胞亚群进行描述，但是使用无偏倚的scRNAseq方法可以进行更全面的注释。在人肝脏中，有孔的LSEC可以通过CLEC4G、CLEC4M、STAB2和CD14等标记进行区分。人LSECs显示基因集富集清除和免疫调节功能，并显示转录因子GATA4活性增强。保持GATA4在维护鼠LSEC规范和功能中的关键作用。RSPO3+中心静脉、AIF1L+肝动脉和podoplanin (PDPN)阳性淋巴内皮细胞(LECs)的不同人群也可能被进一步注释，这有助于进一步研究这些内皮亚人群在肝病中的功能作用（图2和图4）。
3.1.LSEC 区带
除了为肝脏内细胞异质性提供了新的见解，scRNAseq还揭示了先前未知的横跨肝小叶的LSECs功能分区。Halpern等人利用从他们的肝细胞分带工作中获得的空间信息，并将这些数据与一种新的方法结合起来:配对细胞测序(pcSeq)。这项技术对附着细胞的mRNA进行序列，利用一对细胞中一个细胞系的基因表达谱来推断另一个细胞的空间坐标。这种方法能够表征肝脏内内皮细胞的分带性，表明LSECs在小鼠肝小叶中呈高度分区化和功能特化。这种内皮细胞区带的模式在2019年的另一项研究中得到了证实。在人类中，LSECs的scRNAseq分析也显示了显著的分区和15,67%的LSEC基因沿门静脉中轴分布。LSEC分区亚群的基因集富集分析突出了与位于同一区域的其他肝细胞类型共享的功能通路，例如，中分区LSEC和肝细胞共表达通路——与配体受体结合和摄取相关的途径。这一发现表明，在上皮细胞和非上皮细胞中，每个小叶带的不同功能都可能受到保守的分带调控。重要的是，通过比较小鼠和人类的scRNAseq数据，发现区域划分的跨物种保护有限，这就强调了研究人类组织和细胞以了解区域划分与人类疾病发病机制的相关性的重要性。
3.2.肝脏疾病的血管反应
肝损伤引起肝血管的实质性变化，包括LSEC玻璃孔的丢失和有组织的基础膜的形成。这种LSEC毛细血管化被认为在纤维形成中起关键作用，部分是通过抑制星状细胞激活。此外，肝脏脉管系统的变化已知可调节肝脏疾病发病机制的多个方面，包括炎症、再生、癌变和门脉高压。对健康人和肝硬化人肝脏组织的scRNAseq数据进行比较分析，发现疾病相关的CD34+PLVAP+VWA1+和CD34+PLVAP+ACKR1+内皮细胞出现了不同的群体，这些群体不存在于健康肝脏中，而是在空间上局限于病变肝脏的纤维化小生态位。在功能上，疾病相关的内皮细胞显示出增强的白细胞迁移，表明其在调节肝脏炎症中发挥作用。在小鼠NASH模型中，大于10000肝内皮细胞的scRNAseq在损伤后也表现出转录谱的改变。在肝损伤的反应中，所有的内皮细胞亚群都表现出参与脂质代谢、抗原表达和趋化因子释放的基因上调，同时调节血管发育和稳态的基因降低。使用公开的微阵列数据，在人类NASH活检样本中研究了许多肝血管基因表达变化，确定了内皮因子如CXCL9和FABP4在人和小鼠NASH中的上调。这种类型的比较分析提供了一个框架，鉴定和功能的具体致病途径。淋巴管中排列着一群不同的LECs，在炎症性疾病中起着重要的调节作用。使用scRNAseq，可以通过PDPN表达来区分人的LECs(图4)。PDPN免疫组化显示，在稳态状态下，肝脏淋巴血管局限于门脉周围区域，但在肝硬化肝脏中扩张并填充纤维化小生态位，而不考虑肝脏疾病的影响。来自患病肝脏的LECs具有高增殖能力，并表达高水平的趋化因子CCL21。有趣的是，比较来自不同肝病病因的LECs的转录谱，NASH患者的LECs表现出最大的IL-13信号的富集，IL-13信号是一种细胞因子，已知调节纤维原。功能性分析表明，氧化低密度脂蛋白在NAFLD发病机制中起作用，在体外和体内诱导人LECs产生IL-13。这些数据也强调了scRNAseq在定义罕见细胞类型亚群的疾病特异性反应方面的效用。
4.肝间充质细胞生物学
间充质细胞在肝脏中异质分布，包括四种主要亚型:肝干细胞，是肝脏特有的周细胞，分布于肝窦周围间隙的实质中;门静脉成纤维细胞，构成门静脉小生境;血管平滑肌细胞(VSMCs);和间皮细胞。在稳态期间，造血干细胞储存维生素A(视黄醇)，并参与视黄醇代谢和免疫调节，而门脉成纤维细胞支持肝动脉、门静脉和胆管的血管系统。肝损伤后，间充质细胞在肝脏疾病的发病过程中起关键作用，是肝纤维化过程中致病性细胞外基质分离的主要来源。因此，它们作为潜在的抗纤维化治疗靶点引起了广泛的兴趣。
4.1.细胞不均一性和区带
尽管间充质细胞亚群在肝纤维坏死的发病机制中发挥了关键作用，但在人肝组织中对其特性的研究仍然有限。这种情况可能在一定程度上反映了细胞分离的难度，在以前的人类肝scRNAseq ATLAS研究中，间充质细胞只代表了非常小的前部分细胞。然而，在scRNAseq之前，通过使用荧光激活的细胞分选来富集非实质细胞亚群，已经获得了更好的解决人间充质细胞异质性的方法。具体地说，已经鉴定出不同的人造血干细胞、成纤维细胞、VSMCs和间皮细胞群体。在小鼠中，使用有效的间充质细胞分离技术和一株泛间充质细胞报告株，scRNAseq数据现在也为不同的肝间充质细胞群提供了进一步的可靠定义。先前曾使用免疫染色和形态学分析在猪肝脏中描述过肝小叶间HSCs的异质性。然而，结合scRNAseq和空间绘图首次确定了健康小鼠肝小叶的星状细胞区域分布。肝细胞被划分为两个地形图直径的肝叶区域，指定为门静脉相关的肝细胞和中央静脉相关的肝细胞。未来针对人肝组织间充质的以scRNAseq为基础的靶向研究，将使人们能够探究肝间充质细胞的区带是否能在不同物种间保持不变。
4.2.肝纤维化的间充质细胞
在过去的30年里，研究者对调节肝纤维化的细胞和分子机制的理解在很大程度上是通过临床前模型实现的。产生胶原的肝肌成纤维细胞的来源已在啮齿类动物模型中进行了广泛的研究，HSCs被认为是肌成纤维细胞池的主要贡献者。目前，scRNAseq已被用于研究小鼠HSCs的功能区域分布，使高分辨率识别导致小叶中心型肝损伤的关键致病性胶原生成细胞。值得注意的是，伪时间轨迹和RNA速度分析表明，中央静脉相关的造血干细胞是小叶中心肝损伤后致病性胶原生成细胞的主要来源。此外，使用scRNAseq技术从纤维化小鼠肝脏分离的视黄醇阳性肌成纤维细胞证实了之前未知的异质性和肌成纤维细胞的功能多样性。进一步的研究将着眼于对这些不同的肌成纤维细胞群体进行空间定位，并将目前的发现与反映人类肝病不同病因的其他肝纤维化模型进行比较。在人的肝硬化肝脏中，产生胶原的系间组织细胞以高水平的PDGFR表达而区分，并位于纤维化的壁龛中。与小鼠研究相似，对人scRNAseq数据的计算分析表明，HSCs可能是产生胶原的疤痕相关间质细胞来源。然而，与其他细胞系相比，这些人类研究中目前纳入的间充质细胞总数仍然较低，这突出了需要进一步的scRNAseq数据来充分研究间充质细胞的异质性和在人类肝病中的功能。
5.受体－配体相互作用模型
scRNAseq研究已经为肝脏稳态和疾病中的细胞异质性和功能提供了丰富的新见解。scRNAseq分析不仅能够识别不同的细胞类型，还能确定哪些细胞亚群表达特定的基因以及表达的程度。因此，这些数据可以被进一步分析，以研究不同细胞类型之间潜在的配体受体相互作用，并突出可能促进疾病进展的细胞和分子机制。
图5. 纤维化壁龛内细胞的相互作用
现在有许多计算方法可以对scRNAseq数据进行体间分析。在肝脏中，在SAMacs、内皮细胞和间充质细胞中应用无偏倚的CellPhoneDb算法，已确定了许多促进间充质细胞激活和纤维形成的途径（图5）。具体来说，SAMacs表达的配体包括AREG、TGF-beta1, IL-1 beta,TNFSF12和PDGFB，这些配体可通过其同源受体EGFR、IL1RA、TNFRSF12A和PDGFR alpha在伤口愈合相关间充质细胞上表达，可能促进间充质细胞激活、存活和增殖。此外，疤痕相关内皮细胞表达高水平的Notch配体JAG1、JAG2和DLL4，这些配体可通过疤痕相关间充质细胞表达的Notch受体发出信号. 利用体外共培养系统对这些相互作用进行建模，证实了NOTCH信号通路，特别是NOTCH3，在活化的HSCs促进原纤维胶原生成中的作用，突出表明NOTCH通路是抗纤维化治疗的潜在靶点。使用scRNAseq数据建立配体受体相互作用的模型也已在小鼠NASH模型中进行。作者继续鉴定了一组独特的分泌因子，这些因子在HSCs中表现出富集表达。这些被称为stellakines的因子，其中许多在小鼠NASH模型中升高，被预测主要作用于内皮细胞和免疫细胞，突出了HSCs在协调肝损伤反应中的重要作用。这种方法也强调了G蛋白偶联受体在HSCs上的过表达。体外功能研究证实，这些G蛋白偶联受体可调节细胞收缩活性，提示HSCs在控制中发挥作用。因此，交互体分析代表了scRNAseq数据的一个非常强大的应用，解决了复杂的多细胞疾病过程中的关键致病途径，并定义了相关和可行的治疗靶点，然后可以进行功能研究。
6.未来展望
单细胞领域仍在快速发展，该领域的多种新兴、强大的技术可能在未来几年推动生物医学研究达到新的分辨率和精度水平。现有的单细胞肝脏研究通常也需要获得新鲜组织，限制了病例组合和研究全谱肝脏疾病的能力。然而，新的方案能够测序单细胞或单核从低温保存的组织样本，可以促进原始肝活检标本在单细胞分辨率的研究。尽管较低的转录深度和多样性仍然是面临的技术挑战，但这些方法可能提供关于难以分离的细胞类型的额外数据，如肝脏细胞，尽管较低的转录深度和多样性仍然是需要克服的技术挑战。
在健康和疾病的肝细胞生物学方面，单细胞技术助力以前无法实现的新发现。这些多模态单细胞方法的汇总为以单细胞技术调节人类肝脏疾病的分子机制提供了一个良好的机会，将有助于推动肝脏医学的精准化新时代。
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