如何做好微生物组学&代谢组学联合分析研究?

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微生物组学&代谢组学联合分析近年来,随着微生物组学研究的不断发展和持续火热,越来越多的研究者跳出单一的微生物研究,开始将微生物组学和代谢组学联合起来,从物种、基因以及代谢产物等水平共同解释科学问题,获得了很多催人振奋的研究成果。那么关于微生物组学&代谢组学联合分析,您可能有以下疑问:目前微生物+代谢组的热门研究领域都有哪些?微生物&代谢组联合分析更好地解决了什么问题?代谢组学都能检测什么内容?“广筛”和“靶向检测”,有什么区别,该怎么选择?要做联合分析,怎么进行取样?不同类型或者部位的样本可以做联合分析吗,研究的侧重点是什么?联合分析需要多少生物学重复?如何进行联合分析?能够得出什么结果?本文将逐个为您解答~

目前微生物+代谢组的热门研究趋势和热门领域微生物组测序可以解决"who is there"(那有谁)和 "what are they doing"(在干嘛)的问题。而代谢组学是研究生物体中代谢产物变化的科学,常用研究方法包括了:LC/MS(液质联用),GC/MS(气质联用)和NMR(核磁共振),可以解决"what have really happened"的问题。在科学网基金频道(http://fund.sciencenet.cn/)检索2019年国家自然科学基金中标情况,以“肠道菌群代谢”为关键词,查询到项目共621条,累计金额30575万元。中标项目涉及多个领域,在疾病肿瘤研究,中医中药研究、畜牧水产研究、食品科学研究中都均有涉及。可见肠道菌群与代谢组学的联合分析必然是今后肠道菌群研究中很重要的方向。

接下来我们简单地了解一下几个中标基金的题目:1疾病肿瘤研究

2中医中药研究

3食品科学研究

4畜牧水产研究

微生物&代谢组联合分析解决了什么问题?知道了样本当中有了哪些微生物,和他们具有的功能后,就需要进一步的验证这些功能是否真的发生了,发生的程度是什么样的。这时候单纯的微生物组学是无法完成验证的,而代谢组学就是非常好的一种方法,因此代谢组学是微生物组学研究重要的辅助和验证方法。我们从近期发表的几篇高水平文献中看看这种方法应用的趋势。

题目:肠道菌群及代谢物与自闭症谱系障碍[1]发表时间:2019年5月发表杂志:Cell, IF:36.2方向:疾病研究

本研究中利用16S测序 + 宏基因组测序 + 代谢组学检测(GC-MS和NMR)的方法证实了肠道菌群与自闭症的发病及行为学异常存在直接的因果性关系。其中这幅图是基于微生物组学测序和代谢组学检测结果的基础上绘制的,展现了可能参与某种代谢产物产生或降解的菌种。最终结果显示肠道菌群可以通过产生刺激神经的代谢产物影响大脑兴奋-抑制平衡或者氨基酸的代谢,进而调节小鼠的复杂行为。这篇文章证明的因果关系是一个重大突破,而这必须归功于联合分析的功劳,因为这是单一的微生物研究达不到的研究效果。

题目:肠道菌群及代谢物与炎症性肠病(IBD)[2]发表时间:2018年12月发表杂志:Nature microbiology,IF:14.1方向:疾病研究

本文利用了微生物宏基因组测序+代谢组LC-MS检测的方法,深入剖析了代谢物与微生物间的关联,对于理解炎症性肠病发生的原因和潜在诊断和治疗靶点鉴定提供了一定的理论依据。此图中展现出来了差异代谢物与差异菌群的显著关联关系,例如在IBD中富集的长链不饱和脂肪酸ETA(Eicosatrienoic acid)与健康相关物种Eubacterium ventriosum呈负相关。随后还根据代谢组学与宏基因组学数据利用随机森林预测模型可对IBD与非IBD进行区分,结果具有高度精确性。这篇文章极大的扩展了炎症性肠病的研究结果,找出了菌群和代谢产物的对应关系,这必须归功于微生物组学+代谢组学的研究方法。

题目:不同类型饲料的摄取引起牦牛瘤胃代谢和微生物群落的动态变化[3]发表杂志:2019年5月22日发表杂志:Frontiers in Microbiology,IF:4.29方向:畜牧研究,16S测序+代谢组GC-MS,LC-MS检测

在畜牧领域,微生物+代谢组也是一个非常重要的研究思路。本文结合代谢组与微生物多样性对饲喂不同类型饲料的瘤胃液进行联合分析,发现代谢物和微生物群落组成的差异。例如细菌BS11与油酸、肾上腺素、硬脂酸和棕榈酸呈负相关。普氏菌科UCG-003主要与L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-蛋氨酸、次黄嘌呤、L-谷氨酸、肾上腺素、硬脂酸和棕榈酸呈负相关,与L-多巴呈正相关等。通过这些结果可以更好地了解瘤胃代谢产物和微生物功能,从而促进现代牦牛饲养策略的发展。值得一提的是,本篇文章在微生物与代谢双层面上阐述了不同饲料对牛瘤胃影响的原因和机制,相较于先前的单一微生物研究,明显更加深入。从案例中可以看出,单一的微生物组学已经不能满足当前研究需求。想在肠道菌群领域再发表不错水平的文章,采用微生物+代谢组学联合分析的方式才是大势所趋。

常用微生物组学检测内容研究对象研究方法研究目的微生物群落16S/18S/ITS扩增子测序微生物多样性、群落结构组成,菌种丰度,差异菌种分析,关联分析微生物群落宏基因组测序微生物多样性、群落结构组成,菌种丰度,差异菌种分析,基因分析,功能分析,通路分析,基因草图构建在这里想要强调的是,无论是16S扩增子测序、宏基因组测序都是可以和代谢组学进行关联的。代谢组学与16S的检测主要是微生物多样性,种类和相对丰度与代谢产物丰度的关联。宏基因组与代谢组学的关联主要是其代谢通路与基因功能的关联。

代谢组学检测内容NMR平台:适合检测水溶性初生代谢产物——脂质代谢、糖类代谢、氨基酸代谢及能量代谢。可实现绝对定性定量检测。靶向检测与非靶向检测56种氨基酸类49种酰胺类25种糖类96种有机酸类14种药物及食品类6种醇类34种核苷酸类12种维他命及咖啡因类40多种新增物质GC-MS平台:适合检测易挥发,热稳定且不易降解物质。非靶向广筛可以实现相对定性定量检测,靶向检测可以实现绝对定性定量检测。靶向检测非靶向广筛32种氨基酸氨基酸、生物碱、脂肪酸、酚类、醇类、极性有机化合物等37种脂肪酸8种短链脂肪酸LC-MS平台:适合检测易电离物质非靶向性广筛,也常用于次生代谢物的靶向性研究。非靶向广筛可以实现相对定性定量检测,靶向检测可以实现绝对定性定量检测。靶向检测非靶向检测48种胆汁酸(含初级与次级)有机酸,有机胺类,核苷酸,生物碱,醇类,类固醇类,植物激素,极性有机化合物27种神经递质代谢组接受样本类型:粪便、血清、植物/动物组织、细菌、细胞、尿液、其他体液等

什么是代谢组广筛与靶向检测?

当没有具体思路和明确的检测代谢产物时,可以尝试先进行代谢组广筛(GC-MS或者LC-MS),得到差异较大或者丰度高的代谢产物后再选择靶向检测(临床样本推荐每组30个生物学重复,具有较好的统计学意义)。如有前人研究和自身研究基础,或已知菌群结构特点,可直接选择相应的靶向检测。

联合分析如何取样?★ 基因组和代谢组关联分析,相同类型的样本分别用作微生物测序和代谢组学检测需要同一份样本冻存前提前分装,不同种类样本需要同一时段取样,否则无法关联。★做微生物测序与代谢组检测的样本禁止反复冻融,因为反复冻融会造成粪便菌群和代谢产物的变化,从而导致较大的实验误差,影响后续的分析。★ 需要检测短链脂肪酸,脂肪酸的样本不可冻干,因为其属于易挥发代谢产物。

不同类型或者部位的样本可以做联合分析吗?研究的侧重点是什么?

不同样本类型的组合有着不同的实验目的,老师们可以根据自己的需求进行选择。组合的方式包括但不限于以上的情况。

联合分析需要多少生物学重复?根据我们的经验,不同的样本类型,我们建议不同数量的生物学重复样本数量,以达到更好的统计学效果。

如何进行联合分析?能够得出什么结果?

在进行联合分析研究的时候,主要分为三步。第一步决定微生物测序的样本类型,进行微生物的测序研究;第二步决定代谢组检测的样本类型和代谢组检测平台进行检测;第三步把两方面的数据进行关联分析。在关联分析后我们会得到以下的表格:

此表格会对微生物与代谢产物进行Spearman correlation的关联分析计算,得出关联系数r值,此值可以体现某特定微生物与代谢产物的关联性,基于r值,我们可以绘制出以下图片来更直观的展示结果。

微生物与代谢产物关联分析热图横坐标为代谢产物,纵坐标为菌种名称。关联分析热图代谢物能够快速直接判断代谢物与微生物的相互关系。

微生物与代谢产物(大类)关联分析热图基于微生物与代谢产物关联分析热图做出的进一步整理,可以快速直接判断代谢物大类与微生物的相互关系。

微生物与代谢产物关联网路图对于典型相关的微生物/代谢产物的可视化展示是非常重要的结果,而关联网络图就可以达到直观展现典型相关的微生物/代谢产物相互关系的目的。

典型微生物/代谢产物散点图分析散点图分析可以进一步验证典型和微生物/代谢产物相关性系数分析的真实性,从而去除假阳性的强相关作用。

差异菌种代谢功能与代谢产物关联分析图在找出差异的菌种功能前提下,此图可以直观的显现出差异功能和代谢产物之间的相关性。本文转载于阅微基因Microread公众号,仅用于学术分享,如有侵权,请联系删除!

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