科研 | Neurobiology of Stress ：植物乳杆菌P-8通过调节肠道菌群缓解人体压力及焦虑症状的潜在作用机制
编译：九卿臣，编辑：木木夕、江舜尧。
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随着现代社会的快速发展,人们生活水平普遍提高,由于长期处于快节奏下,人们的压力也越来越大，极易诱发精神类疾病。最近的研究表明，压力会破坏人类肠道微生物群的平衡，进而会引发焦虑和抑郁等心理健康问题。益生菌可通过平衡体内细菌的数量和促进良好的新陈代谢来创造健康的肠道环境，被认为是预防和治疗精神类疾病的一种有前途的工具。前期的临床试验中已发现，摄入12周的植物乳杆菌P-8（P-8），可有效缓解成人压力及焦虑症状；然而，其潜在机制尚未明确。
本研究旨在探究P-8作用于肠道菌群缓解人体压力及焦虑的潜在机制。对安慰剂组（N=36人）和益生菌（P-8）组（N=43人）的粪便样本宏基因组进行基因组组装发现，与第0周相比，安慰剂组Shannon指数在第12周显著下降（t-test；P < 0.05），而P-8组无显著性差异。益生菌干预后受试者肠道中青春双歧杆菌（Bifidobacteriumadolescenti）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、普氏栖粪杆菌（Fecalibacterium Prausnitzii）等含量显著增加；而粪便罗斯拜瑞氏菌（Roseburia faecis）和 Fusicatenibacter saccharivorans 含量显著减少。结果表明，P-8可通过调节肠道菌群，促进肠内一些关键神经递质和神经活化物的产生和分泌，经过迷走神经、细胞因子和微生物源代谢物直接和间接调控肠脑轴，进而缓解成人压力和焦虑症状。
论文ID
原名：Probiotic consumption relieved human stress and anxietysymptoms possibly via modulating the neuroactive potential of the gut microbiota
译名：益生菌干预通过调节肠道菌群的神经活性潜能来缓解成人的压力和焦虑症状
期刊：Neurobiology of Stress
IF：7.197
发表时间：2021.01
通讯作者：张和平
通讯作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室
前言
压力是人类日常生活中无处不在的一部分，严重时会导致焦虑甚至抑郁。抑郁症影响着全世界超过3亿人，每年导致近80万人自杀。最近的研究表明，压力和抑郁的风险与肠道微生物群有关。肠道微生物广泛参与各种激素和肠-脑轴相关神经递质的合成/释放，进而调节大脑功能和宿主行为。众所周知，胃肠道紊乱会影响精神状况，包括压力、焦虑、抑郁、帕金森病和阿尔茨海默病。由于益生菌可调节宿主肠道微生物群及其合成/释放某些神经活性化合物，因此益生菌疗法已被认为是一些神经系统和神经退行性疾病的替代治疗方法。最近的临床研究表明，一些益生菌菌株可以帮助缓解压力、焦虑和抑郁症状。然而，大多数研究集中于通过实施行为测试、认知评估和问卷调查来评估症状缓解的临床效果；一些研究试图描述益生菌促使的肠道微生物分类学（基于16S rRNA）的变化。但由于缺乏相应的参考基因组，未能阐明肠道菌群的功能及其神经活性潜能。微生物参考基因组是微生物图谱、宏基因组注释和破译其生理功能不可或缺的工具，近年来，从宏基因组恢复重建宏基因组组装基因组（MAGs），大规模扩展了人类肠道参考基因组，揭示了肠道微生物组在人类健康中的作用。
高质量的人类和动物相关研究表明，肠道微生物群在许多压力相关条件下发挥着影响作用，然而，肠道微生物组在压力条件下的因果关系和贡献程度尚不清楚。前期的临床试验中已发现，摄入12周的植物乳杆菌P-8，可有效缓解成人压力及焦虑症状；然而，其潜在机制尚未明确。本研究旨在从肠道微生物组的角度阐明这一机制。
试验设计
本试验采取随机、双盲、安慰剂对照方法，招募了79名年龄在18-60岁的处于中等压力的成年志愿者参与为期12周的临床试验，其中P-8组43人（33名男性，10名女性），而安慰剂组为36人（28名男性，8名女性）。P-8组志愿者每日服用植物乳杆菌P-8（2 g; 2x1010 CFU/天），安慰剂组每日服用等量的安慰剂。分别在第0周和第12周采集两组志愿者的粪便样本，共计158份，使用QIAamP Fast DNA Stool Mini Kit 对158份粪便样本进行DNA提取，用琼脂糖凝胶电泳和纳米分光光度计检测DNA质量，Illumina HiSeq 2500对得到的DNA进行宏基因组测序经质控后生成1.31TbP的高质量reads。Binning后得到高质量基因组3803个，去冗余后选出代表性种水平基因组（SGBs）589个。
图1 试验设计及分析流程图
结果
1. 肠道微生物群的基因组特征
宏基因组测序样本binning后得到了3803、851和1240个高质量、中质量和低质量的MAG（宏基因组组装基因组），经dreP去冗余后得到代表性的种水平基因组（SGBs）589个（图2a），其中包括13个门、23个纲、30个目、49个科、91个属和341个种，大部分SGBs属于厚壁菌门（57.72%），其它为拟杆菌门（14.60%）、放线菌门（12.56%）和变形菌门（8.15%）。为研究潜在未被发现的SGBs，将589个SGBs与IGG和MAGs数据库进行比对后，发现本研究中存在78个可能的新种（图2b）。有50个SGBs在物种水平上不可培养，归属于三个门，即厚壁菌门（72%）、拟杆菌门（11.67%）和变形杆菌门（4%; 图2c）。
图2 肠道微生物群的基因组特征。（a）在589个SGBs中，539个是可培养的，50个是不可培养的。（b）通过与IGG（包括16,136个非冗余的代表性人类肠道基因组的数据库）和MAGs（包括154,723个全球人口肠道和身体其他部位的非冗余基因组的数据库）数据库进行比对，发现78个新种。这78个SGBs的基因组在此研究中，与现有分离株或人类微生物组数据集的宏基因组组装基因组比较无重叠。（c）589个SGBs的系统发育树分布情况。系统发育树外圈部分表示在试验期间SGBs的log2 RPKM倍数变化。
2. 服用益生菌P-8可调节受试者肠道微生物组成
图3 压力状态下成年人肠道微生物的结构、多样性变化情况。（a）非度量多维尺度（NMDS）分析（Bray-Curtis similarity index），安慰剂（Pla）和益生菌（Pro）组样本用不同的颜色表示，三角形和圆形分别代表第0周和第12周的样本。（b）安慰剂组的肠道微生物（第0周与第12周）Aitchison 距离明显大于P-8组。（c）两组不同时间点的Shannon指数。
3. 益生菌P-8调节肠道微生物群参与神经活性相关的通路
为了观察589个SGBs神经活性相关通路的变化（基于MetaCyc and KEGG数据库），重点探究了糖发酵、氨基酸利用、短链脂肪酸、肠道酶相关的肠道微生物代谢通路。结果表明，与神经活性物质转化、代谢途径相关的共有12个门，主要分布在厚壁菌门（53.47%）、拟杆菌门（18.79%）和放线菌门（12.20%）。乙酰辅酶A转化为乙酸（95.93%）、谷氨酰胺降解II（ 89.98%）和类胡萝卜素依赖酶（96.69%）是三种最普遍的途径（SGBs中的流行率 > 80％）。GBMs 丙酸降解I、一氧化氮降解II、犬尿氨酸合成是三种稀有模块（SGBs中的流行率< 5％），归属于变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）。
图4参与编码神经活性代谢相关通路或肠脑模块（GBMs）的SGBs在不同门的分布。门名称旁数字表示在该门中SGBs的分布数量。紫色、浅蓝色和红色三角形分别代表稀有、一般和普遍的路径。
4. 益生菌P-8可调节肠道微生物群相关的神经活性化合物
Valles-Colomer等人（2019）开发的基于模块的分析框架用于表征样品中的神经活性化合物。本研究中有32个和17个差异丰富的模块与神经活动的合成和降解有关，对合成和降解相关模块按其代谢潜能分为6个功能性亚群（图5a）为了描述关键的潜在神经活性化合物，分析了不同SGBs编码的GBMs，这些GBMs表明了P-8组和安慰剂组之间的显著性差异。两组间编码合成相关GBMs （SGBMs）的总丰度仅在第12周有显著性差异（P < 0.001），而在第0周无显著性差异。P-8组和安慰剂组在第12周的编码SGBMs I（氨基酸及其衍生物合成）和SGBMs IV （SCFAs合成）的SGBs之间的丰度差异性很大（P < 0.01）。此外，SGBMs II中SGBs的丰度 [神经递质I的合成；含有三种γ-氨基丁酸的合成途径（GABA）] 在第12周时P-8组更高。另一方面，在第12周，两组参与降解相关的模块（DGBMs）的SGBs总丰度存在显著性差异。P-8组中编码DGBMsII（神经递质I降解）和DGBMs III（神经递质II降解）的SGBs丰度在0 -12周有显著性差异。在第12周时，P-8组发现更高多样性的SGBs参与维生素K2合成、SCFAs和GABA代谢；而安慰剂组更高多样性的SGBs参与了肌醇降解。相比于安慰剂组，P-8组受试者在第12周肠道内出现了更多的SGBs参与皮质醇降解。编码组胺合成的SGBs在益生菌组受试者肠道内12周时更多的出现。
图5 （a）肠脑模块（GBMs）在门水平的分布。在益生菌（Pro）和安慰剂（Pla）组中，显示了不同类型的合成相关的模块及其在门水平上的组成。（b）肠脑模块由益生菌组和安慰剂组之间的特定显著差异SGBs编码。在第12周，圆形和正方形分别代表两组模块的富集和减少。
5. 益生菌和安慰剂组在两个时间点的微生物群神经代谢物特征
MelonnPan用于研究SGBs与潜在神经代谢物质之间的相关性。共预测出80种代谢物，脱氧胆酸、谷氨酸和胆酸盐是三种含量最高的代谢产物。通过NMDS分析评价两组微生物群的结构差异，研究结果表明微生物预测代谢物在0周和12周之间有明显差异（stress = 0.0862；图6a）。Procrustes分析表明，微生物群和预测代谢产物间呈正相关（r = 0.386；P = 0.001；图6b）。在12周的试验后，P-8组和安慰剂组的肠道代谢物都发生了显著的变化（P < 0.001），而ANOSIM分析显示在第0周时发现两组代谢产物无显著性差异。
从P-8组和安慰剂组分别鉴定出41个和12个差异丰富的代谢物，它们在第0周和第12周之间预测的丰度水平具有显著性差异。一些其他的预测代谢物在临床试验后具有相同的变化趋势，例如在第12周，两组的泛酸盐、烟酸盐和石胆酸盐的预测丰度显著降低，而胞嘧啶的预测丰度显著升高。此外，在12周时，P-8组受试者肠道内胆酸、花生四烯酸、肌酸、苏氨酸鞘氨醇、赤酮酸和鞘磷脂的平均预测含量显著高于安慰剂组（图6c）。
图6 益生菌（Pro）和安慰剂（Pla）组在两个时间点预测肠道代谢物之间的差异。（a）非度量多维标度（NMDS，Bray-Curtis相似性指数）和（b）在两组的第0周和第12周时对受试者的微生物群和预测的代谢物进行了Procruste分析，显示两者之间呈显著的正相关（r = 0.386; P= 0.001）。（c）P-8组在第0周和第12周之间预测的差异神经活性代谢产物。
讨论
本研究观察处于中等压力状态下的受试者服用P-8菌株后，肠道菌群结构在益生菌驱动下的变化情况。P-8通过调节肠道微生物群对焦虑、抑郁等相关症状的缓解作用已在先前的研究中报道。
有趣的是，在第12周，安慰剂组的Shannon多样性指数显著降低（P < 0.05），而P-8组没有显著差异。一项双盲、安慰剂对照的临床试验发现，在8周益生菌干预后，缓解压力相关症状的同时志愿者的肠道菌群多样性也有所增加。一般来说，较高的肠道菌群多样性被认为是维持健康生理状态的重要因素，而不健康的情况（如胃肠道不适、克罗恩病和一些癌症）与肠道菌群多样性减少有关。Aitchison距离代表了两种微生物群落的微生物结构和组成的差异，Alpha多样性（如Shannon指数）反映了样品中微生物的丰富度和均匀度，但其它研究结果表明，高多样性并不一定是“更好的”或“健康的”，因此，在我们的研究中观察到的安慰剂组和P-8组在肠道菌群多样性上的不同只能解释为对个体的不同反应。此外，与P-8组相比，安慰剂组有更加显著的个体内Beta多样性，这表明动态的微生物群变化不仅发生在P-8组，也发生在安慰剂组。在第12周，发现P-8组受试者肠道内一些SGBs的含量显著增加（如B. adolescent, B. longum, F. Prausnitzii），而R. faecis, Fusicatenibacter saccharivorans则显著下降。青春双歧杆菌（B. adolescentis ）具有抗焦虑和抗抑郁的作用，其作用机制是平衡肠道微生物群，降低炎症细胞因子；摄入长双歧杆菌（B. longum）改善了健康成人对压力的生理/心理反应，并提高了视觉空间记忆。此外，发现青春双歧杆菌（B. adolescent）,长双歧杆菌（B. longum）和普氏双歧杆菌（F. Prausnitzii）与压力、焦虑得分呈现负相关，而粪便罗斯拜瑞氏菌（R. faecis）与这些得分呈现正相关。另外乳酸菌（Lactobacillus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）和粪杆菌（Faecalibacterium）与大脑健康呈正相关，对神经系统疾病具有调节和保护作用。这些结果表明，维持健康不仅依赖于肠道菌群的多样性，还依赖于特定的肠道功能菌种/菌株。
研究已表明，编码肠脑模块的微生物群可能是缓解压力及焦虑症状的主要参与者，但需要更多的研究来确定益生菌摄入后GBM变化情况。在第12周时，发现P-8组更高多样性的SGBs参与维生素K2合成、SCFAs和GABA代谢；而安慰剂组更高多样性的SGBs参与了肌醇降解。其中维生素K2不仅在凝血和抗炎方面很重要，而且还是一种神经保护剂，可以减轻多发性硬化患者复发的严重程度。肠道微生物代谢产物如短链脂肪酸，尤其是乙酸、丁酸、本体酸，是重要的神经免疫内分泌调节剂。相比于安慰剂组，P-8组受试者肠道内在第12周出现了更多的SGBs参与皮质醇降解。编码组胺合成的SGBs在P-8组受试者肠道内12周时出现频率更高。同时，发现益生菌干预后显著提高受试者肠道内胆酸、花生四烯酸、鞘磷脂的平均含量，且有效降低了血浆促炎因子水平（IFN-γ, TNF-α, andIL-1β）。肠-脑轴交流涉及多种途径，通过迷走神经、免疫系统、内分泌系统和微生物源的代谢产物/神经递质之间的双向交互促进。通过MelonnPan研究SGBs与潜在神经代谢物质之间的相关性，发现益生菌的服用增加了SGBs的多样性，而这些SGBs具有神经活性的潜在相关途径，主要集中在糖发酵、氨基酸利用、短链脂肪酸、肠道酶相关的肠道微生物代谢。Procrustes分析表明，微生物群和预测代谢产物间呈正相关（r = 0.386； P = 0.001）。在12周的试验后，P-8组和安慰剂组的肠道代谢物都发生了显著的变化（P < 0.001），而ANOSIM分析在第0周时发现两组代谢产物无显著性差异。皮质醇是一种主要的应激激素，它与不断增加的焦虑/抑郁等应激反应有关，本研究中观察到与安慰剂组相比，益生菌组的血浆皮质醇水平出现了下降；这种下降伴随着更多的肠道皮质醇降解SGBs。肠道-脑轴通信涉及多种途径，通过迷走神经、免疫系统、内分泌系统和微生物源代谢产物/神经递质之间的双向交互促进。因此，肠道菌群的平衡可能紧密调节宿主的炎症反应，激活肠道和循环免疫途径，进而会影响宿主的情绪和大脑功能。
图7 益生菌调节微生物群的活性代谢潜能通过肠-脑-轴缓解成人压力焦虑潜在机制
评论
本研究以服用植物乳杆菌P-8后调节机体肠道微生物群组成为着眼点，对受试者的肠道基因组特征、微生物群组成、相关神经化合物通路及神经活性代谢物等进行一系列研究。发现P-8通过调节肠道菌群促进神经递质或相关代谢物的分泌，经过迷走神经、细胞因子和微生物源代谢物直接和间接调控肠-脑-轴。从而有利于患者压力及焦虑症状的改善（图7）。
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