科研 | FEMS Microbiol. Ecol.：牛瘤胃中不同木质纤维素类牧草附着微生物群落的时间变化
编译：一瞬流星，编辑：小菌菌、江舜尧。
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瘤胃微生物与饲料颗粒的附着对饲料的发酵，降解和消化至关重要。但是，饲料的理化性质对瘤胃微生物定植的影响程度尚不清楚。我们假设瘤胃微生物群落对木质纤维素特性不同的饲料的附着可能有不同的偏好。为此，在雄性塔莱西牛中原位瘤胃孵育后，分析了附着于具有不同木质纤维素成分的六个普通草料上的微生物群落的结构和组成。
研究发现，在瘤胃培养的前24小时，木质纤维素成分的差异显著影响了牧草附着微生物群落的样品间多样性，在此期间实现了最高的干物质降解。然而，培养时间延长到96小时后，牧草中出现了更均匀的微生物群落。纤维菌在中性洗涤纤维含量最高的牧草上有显著的高表达。瘤胃球菌倾向于含低酸性洗涤木质素含量的牧草有粘附作用。干物质发酵程度与纤维杆菌科、未分类拟杆菌科、瘤胃球菌科和螺旋体属的种群数量显著相关。此外，研究还发现木质纤维素组合物，尤其是纤维素成分，显着影响了微生物对草料的附着，从而最终影响了草料的最终消化。
论文ID
原名：Temporal changes in microbial communities attached to forages with different lignocellulosic compositions in cattle rumen
译名：牛瘤胃中不同木质纤维素类牧草附着微生物群落的时间变化
期刊：FEMS Microbiology Ecology
IF：4.098
发表时间：2020.4
通信作者：Ghasem Hosseini Salekdeh
通信作者单位：伊朗农业生物技术研究所
实验设计
6种常见的木质纤维素类牧草，包括骆驼刺(Alhagipersarum，AP;茎和叶)、普通芦苇(芦苇，CR;茎和叶)、枣椰子(海枣，DP;叶)、地肤(koscoparia，KS;茎和叶)、稻草(Oryzasativa;Hashemi，RS;茎和叶)和盐角草(Salicornia，SC;茎和叶)，进行瘤胃原位培养。将干饲料材料切成2毫米，等量(5±0.05g)放入热封尼龙袋(5x10cm;50μm孔隙大小)。本研究选用了3头2.5-3岁的纯种置有瘤胃瘘管的公牛(塔利时牛，一个伊朗本地品种)，在其早晨饲喂不久后，将48个热封袋，每个饲料8个，同时通过瘘管置于三头牛的瘤胃中。这些公牛被饲养在一个稳定的环境中，用含有70%麦秸和30%精料的混合饲料喂养，自由饮水。在孵育24、48、72和96小时后，从每个瘤胃中分别取回了6个草料中的2个尼龙袋，用蒸馏水彻底清洗3遍，以除去液体和松散附着的微生物，这些可能没有区别用于附着到具有不同木质纤维素特性的草料上，最后用无菌手套用手挤压以去除多余的水分。最后将袋子置于液氮带回实验室，其中一个重复样品在-70℃下保存，用于随后的DNA提取，而另一个样品则进行理化分析。在瘤胃孵育前后，分别检测饲草料中干物质（DM）、中性洗涤纤维（NDF），酸性洗涤纤维（ADF）和酸性洗涤木质素（ADL）的含量。
结果
1 瘤胃孵育前牧草的理化特性
在瘤胃孵育前，6种牧草的NDF、ADF、ADL、纤维素和半纤维素含量测定见图1。NDF含量差异有显著性（P<0.05），AP含量最高，RS和SC含量最低。不同牧草的ADL含量也有显著差异（P<0.05），AP最高，为DP组的2倍，为SC、CR和KS的3倍（后两者含量相近，P>0.05）为RS的六倍（24.86%vs4.06%）。CR的纤维素含量最高，DP、RS、KS和SC次之，AP的纤维素含量最低（P<0.05）。半纤维素含量SC最高，其次为CR、KS、RS、DP和AP。总体来说，六种牧草的半纤维素、纤维素和木质素的相对含量不同，理化性质也不同。
图1. 6种牧草在瘤胃饲养前后干物质(DM)和中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、酸性洗涤木质素(ADL)、纤维素和半纤维素含量的差异。每个箱线图中的实心圆和误差条分别表示均值和标准差。采用单因素方差分析确定差异有统计学意义。使用DMRT比较均值，在每个采样间隔用不同的字母标记P<0.05。AP：骆驼刺；CR：芦苇；DP：枣椰子；KS地肤；RS：稻草；SC：盐角草。
2 瘤胃孵育后木质纤维素生物质的降解
测定了6种牧草在瘤胃原位孵育过程中DM、NDF、ADF、ADL、纤维素和半纤维素含量的变化（图1和图S1）。在孵育的前24h内，DM在AP中的降解最快，而在CR中最慢(42%vs34%，P<0.05)。DM的降解在24小时内在AP中完成，但在CR和KS中持续至48小时，在DP，RS和SC中孵育长达96小时，其中DM降解最高（66％），其次是SC（ 56％）和DP（53％）。AP中DM的降解在24小时内在完成，但在CR和KS中持续至48小时，在DP，RS和SC中孵育长达96小时，其中DM降解最高（66％），其次是SC（56％）和DP（53％）。AP，DP和KS表现出相似的趋势，即NDF，ADF，ADL和纤维素含量显着增加（P <0.05），反映出其DM降解模式，主要是在前24小时内，但半纤维素含量持续下降（P <0.05，在大多数情况下）。但是，在孵育过程中，这5个与纤维相关的参数的模式在CR，RS和SC之间显著分离。虽然ADF和ADL显著升高，但CR和SC中纤维素含量却显着下降（P <0.05），但NDF和半纤维素呈相反的模式，在整个培养过程中CR显着降低，同时在SC中稳定积累（P <0.05）。在整个培养过程中，RS中的ADF，纤维素和半纤维素保持稳定水平，而其NDF和ADL则略有增加（P <0.05）。可见，纤维相关理化性质的初始差异显著影响了6个牧草的瘤胃消化。
3 16S rRNA基因测序
16S rRNA V3-V4区PCR扩增子双端测序得到5945300对原始序列（每个样本平均有82573个序列），平均长度为300bp。将序列连接在4421604个全长扩增子中，平均每个样本61411±38275个。样品测序深度的不均匀可能是由于样品微生物丰度的真正差异，或在文库制备和测序过程中引入的技术差异。尽管不同牧草和瘤胃孵育时间的序列数量差异很大，但总体上呈现出从24h最低（平均44100个样品）到72h最高（平均95823个样品）的稳定增长模式。在处理用于OUT分析的扩增子序列之前，先对其进行了质控，得到了3602510个高质量序列，其中994147（27％）被鉴定为嵌合的，因此从进一步的分析中被丢弃。符合分析条件的序列（2493285）以97％的相似度分为110804个OTU，其中106982个（96.5％，代表202403个序列）被标记为低丰度特征从OTU表中筛选出来。最后，对代表2290 882个序列的3822个清洗过的OTU进行下游分析。为了评估我们的测序工作是否提供了足够的测序深度来描述附着于饲草微生物群的多样性，稀疏曲线描述了观察到的OTU数量，物种丰富度，所有样本在不同测序深度产生Shannon和Simpson多样性（图S2a-d）。根据观察到的物种和物种丰富度进行的稀疏分析表明，微生物群的采样不完全，从而表明牧草上附着高度多样化的微生物群落（图S2a-b）。而Shannon指数(图S2c)和Simpson指数(图S2d)则处于稳定期，说明大部分多样性已被探索出来。
4 微生物多样性分析
饲料附着微生物Alpha多样性指数的差异主要局限于瘤胃培养的前24小时，在此期间微生物附着的差异最大（图S3）。此时，CR和RS（初始纤维素含量最高的两种牧草）最低，AP和KS（初始纤维素含量最低的两种牧草）的平均观察物种和物种丰富度最高。CR和RS的平均Shannon指数最低，表明其微生物多样性有限（P<0.05）。除了CR在孵育24h的Alpha多样性指数很低外（P<0.05），几乎所有牧草的多样性指数都不受孵育时间的影响（图S4），在所有采样间隔中，所有样品均显示良好的Good's覆盖率（>0.91，未显示数据），表明测序工作得出了与牧草相关的微生物多样性的90％以上。然而，不均匀的测序深度使我们无法充分探索与饲草附着微生物群的多样性。考虑到由于试验动物和重复的数量有限而产生的潜在随机误差，不同牧草间α多样性指数的差异不足以说明任何生物学意义。Bata多样性分析也显示，在不同的牧草之间以及不同的瘤胃孵育期间的差异有限。加权的Unifrac差异矩阵考虑了分类单元的相对丰度及其系统发育距离，分别解释了牧草之间和整个孵化期中21%和26%的差异。PERMANOVA表明，至少一些牧草（如CR和SC）具有不同的微生物群落（图2A，P<0.001），而对群散点的均匀性的检测表明，群散点之间无显著差异（图2B，PERMDISP P>0.1）尽管如此，微生物群落在整个孵育时间长度内微生物群落的差异（图2C，PERMANOVA P<0.001）似乎主要受组内分散的影响，无论是牧草类型还是动物间的差异，尤其在最初的24h内（图2D，PERMDISP P<0.05）这时，附着CR的菌群与附着在其他牧草的菌群分离良好。在整个孵育过程中，由于微生物群落的差异在24h明显，而随后的样品间隔消失，因此整个微生物群落结构在牧草之间显示出明显的转移（图2C，2D）。这一发现表明，瘤胃微生物群对附着于不同消化率的牧草有强烈的偏好，而在瘤胃消化的最初几个小时（24h）后，这种偏好的速率和程度很快受到影响。
图2. 6个牧草瘤胃培养过程中附着瘤胃微生物群落的Beta多样性分析。PCoA图显示了基于加权Unifrac距离矩阵的样本分布，其中样本按照牧草(A)和采样间隔(B)进行分组，采用PERMANOVA检验p值截止值为0.01的显著性差异。每个主坐标解释的变化百分比在相应的轴旁边标出。我们还对分散性的同质性进行了测试，以检验牧草(C)和采样间隔(D)之间的方差差异。使用R package veganv.2.5-5的betadisper函数(999个排列)来确定显著差异。p值<0.05为差异有统计学意义。对于每个处理，数据一式三份，分别代表三个独立的袋子。AP：骆驼刺；CR：芦苇；DP：枣椰子；KS地肤；RS：稻草；SC：盐角草。
5 牧草附着的微生物群落
从塔莱西牛瘤胃中定植在牧草微生物群落中，共鉴定出总共18个细菌门和一个古细菌门。群落以厚壁门菌（45%）和拟杆菌（41%）为主，其次为纤维杆菌（5%）、螺旋菌（3%）和变形菌（2%）。附着在牧草上的主要细菌门丰度变化如图3A所示。ANCOM分析和Duncanposthoc检验显示，不同牧草的拟杆菌、纤维杆菌、小孢子菌和螺旋菌的丰度存在差异(图3B，ANCOMP<0.05)。AP和CR中的拟杆菌含量显著高于DP和SC（DMRTBonferroni P<0.001）。有趣的是，在CR和SC（两种初始NDF含量最高的牧草）的读数中，纤维利用菌的含量超过9%，但在AP、KS、DP和RS的读数中，纤维利用菌的含量低于2%（P<0.05），如图3A。与其他牧草相比，CR含有更多的小孢子菌（P<0.001），而SC含有更多的螺旋菌（P<0.02）。在家系水平上（图5），牧草附着微生物隶属于76科，其中9科在不同的牧草中表现出不同的丰度，分别是：拟杆菌科、梭状芽孢杆菌科、纤维杆菌科、食物谷菌科、克里斯滕森菌科、毛螺菌科、螺旋菌科、草酸杆菌科和RFP12（ANCOMP<0.05）。有趣的是，与其它牧草相比，CR中的食物谷菌科显著高于其它牧草（P<0.05），而与AP，DP，KS和SC相比，拟杆菌科植物的CR和RS显着丰富。在KS和SC中，草酸杆菌比在AP，CR，DP和RS中含量更高（P<0.05）。与初始NDF含量最低的AP、KS和RS相比，纤维杆菌科成员在CR和SC中的出现率也较高（P<0.02），而梭菌科和食物谷菌科成员在CR中的出现率低于其它牧草（P<0.05）。附着颗粒的微生物群隶属于119属（分类学等级6），其中12种在不同牧草中表现出不同的丰度（ANCOMP<0.05，图4），其中大多数是已知在植物木质纤维素降解中起关键作用的瘤胃群落中的高丰度成员，即瘤胃球菌、纤维杆菌，普雷沃菌、螺旋菌、毛螺旋菌、琥珀酸弧菌、假丁酸弧菌、丁酸弧菌、草酸杆菌、梭菌、BF311和琥珀酸菌。瘤胃球菌和BF311在RS中的优势种均高于AP、KS和SC（P<0.001）。纤维杆菌在CR和SC中的代表较高。毛螺旋菌种类在AP和KS中的读数为0.3％（P<0.05），但CR的读数仅为0.11％，SC的读数为0.09％。与CR相比，AP和SC中的琥珀酸弧菌含量高（P<0.05）。与DP和SC中相比，普雷沃氏菌的CR含量更高（>21％的读数）（P<0.008）。与其他牧草相比，CR携带的丁酸弧菌和假丁酸弧菌种类较少（P<0.007）。
图3. (A)牧草附着微生物群落中主要细菌门的reads比例(均数±SD)(n=7)。相对丰度的计算依据是在序列深度为4660个reads时，在精简的OTU表中分配给每个门的reads所占的比例。(B)Box图显示了植物门在牧草上的相对丰度。采用DMRT后P<0.05的ANCOM进行均数比较，差异有统计学意义。中心线表示中值，方框表示四分位数范围，红色表示平均值。不同字母的均值在P<0.05有差异。AP：骆驼刺；CR：芦苇；DP：枣椰子；KS地肤；RS：稻草；SC：盐角草。
图4. 瘤胃孵化后6个牧草属的相对丰度的对数有差异。差异丰度采用ANCOM进行统计检验，p值截止值<0.05。使用DMRT仅接受bonferroni校正的p值<0.05进行均数比较。用不同字母标记的箱形图在统计上有显著差异。中心线表示中值。AP：骆驼刺；CR：芦苇；DP：枣椰子；KS地肤；RS：稻草；SC：盐角草。
6 瘤胃孵育过程中牧草附着微生物的变化
为了研究瘤胃孵育过程中饲草附着微生物的群落组成是否发生变化，每隔24h对微生物的相对丰度进行跟踪（图5）。在119个细菌属中，有8个的丰度在孵育时间上有显著差异（P<0.05）。有趣的是，在AP、KS和SC中，属于未分类瘤球菌科的纤维素分解细菌的比例随着培养时间的延长而线性增加。在CR中孵育48到96h后，纤维杆菌的比例急剧下降，达到平均值的48％。假丁酸弧菌在AP和KS中呈线性下降，而在CR中呈线性上升。SC中梭状芽孢杆菌的数量增加，但普雷沃菌和未分类的紫单胞菌科的数量随着孵育时间的延长而减少，这与Cheng等人的研究结果一致（2017年）。
图5. 在瘤胃孵育过程中(96h，间隔24h)，附着于6个牧草的微生物群落的分类单元(属级)的平均相对丰度有差异。ANCOM法计算差异有统计学意义，DMRT法比较差异有统计学意义。误差条表示标准差，其长度以95%置信区间进行调整。不同字母表示的均数在P<0.05有统计学意义。DP中未发现有差异表达的类群。AP：骆驼刺；CR：芦苇；DP：枣椰子；KS地肤；RS：稻草；SC：盐角草。
7 木质纤维素降解与牧草附着微生物群落的关系
在瘤胃孵育的最初几个小时（24h）内，利用Pearson法对牧草的初始理化性质和附着微生物群的组成进行了相关性分析，以确定瘤胃微生物是否偏好附着特定牧草。分析表明，纤维杆菌科的丰度与牧草NDF含量呈正相关（r=0.77，P=0.03）。在属水平上，纤维杆菌的丰度（r=0.77，P=0.05）呈正相关，但未分类的韦荣球菌属的p-75-a5（r=-0.79，P=0.03）与牧草中NDF含量呈负相关。当考虑半纤维素含量时，与Pirellulaceae呈负相关（r=-0.79，P=0.02）。我们还将瘤胃孵育期间的微生物特征与牧草的理化特性相关联。分析结果表明，纤维杆菌科（r=0.83，P=0.03，CR）、厌氧支原体科（r=0.82，P=0.04，CR）、普雷沃氏菌科（r=0.83，K=0.04，KS）和紫单胞菌科（r=0.85，P=0.02，SC）的丰度呈显著正相关，而瘤胃球菌科（r<-0.85，P<0.01在CR和SC中）和未分类的拟杆菌科（r=-0.84，P=0.05RS）与牧草干物质含量呈负相关。尤其是瘤胃球菌科的成员与CR，DP和SC中的ADF，ADL和半纤维素含量呈正相关（r>0.8，P<0.04），其初始NDF含量最高（图1）。毛螺菌科的丰度也与CR中的纤维素含量呈正相关（r=0.83，P=0.04）。为了确定瘤胃微生物群与木质纤维素降解之间是否存在关系，还对瘤胃孵育期间干物质损失与附着牧草的微生物群落相对丰度之间进行了Pearson相关分析。有趣的是，DM降解与纤维杆菌科（r>0.76，CR中P<0.001）和螺旋菌科（r=0.91，KS中P=0.0004）的发生率呈正相关，但与未分类的拟杆菌科（r<0.82，CR和DP中P<0.05）、瘤胃球菌科（r=-0.83，CR中P=0.04），单胞菌科（r<0.82，CR和RS中P<0.05）和Erysiopelotrichaceae（r=-0.87，CR中P=0.01）呈负相关。纤维素和半纤维素的降解与牧草附着微生物丰度的相关性也表现出相似的规律。
结论
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