科研 | PNAS：芝麻素代谢微生物和一种新酶的发现
本文由殷继忠编译，董小橙、江舜尧编辑。
原创微文，欢迎转发转载。
芝麻素是芝麻油中的主要木脂素之一。芝麻素代谢途径在酶和基因水平上仍未确定。作者分离出以芝麻素作为唯一碳源的微生物。鉴定出一种微生物对芝麻素具有显著降解能力，命名为Sinomonas sp. no. 22。从该菌株中纯化得到芝麻素代谢酶，命名为SesA。在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均发现SesA同源基因， 这种酶具有独特的催化能力，可以通过使环裂解将芝麻素中的亚甲基转变为四氢叶酸（THF）。
原名：Discovery of a sesamin-metabolizing microorganism and a new enzyme
译名：芝麻素代谢微生物和一种新酶的发现
期刊：PNAS
IF：9.661
发表时间：2016年
通信作者：Takuto Kumano
通信作者单位：University of Tsukuba
1、芝麻素代谢细菌的分离与鉴定
芝麻素代谢细菌的分离与鉴定选用的土壤样品从筑波大学芝麻园收集得到。在本研究通过富集培养方法,我们分离出40种以芝麻素为唯一碳源的微生物。作者选择了一个分离株编号22。该菌株99％的16S rRNA基因序列与Sinomonas atrocyanea相似。
2、芝麻素代谢物结构测定
我们培养了22号菌株的提取物为底物，通过乙酸乙酯萃取和HPLC技术分离出两种产物（化合物A和B）。化合物A中没有芝麻素H-10'对应的质子信号，化合物B没有观察到对应芝麻素的H-10和H-10'的质子信号。实验结果证实，化合物A和B分别被确定为芝麻素单胞菌酚和芝麻素邻苯二酚。
图1 芝麻素反应产物的HPLC分析
图2 植物来源的亚甲基二氧苯基化合物及其衍生物的SesA活性
3、芝麻素代谢酶纯化
芝麻素代谢酶纯化1.2倍，产率为3.4％。芝麻素代谢酶的基因SesA的主要结构表明它可能需要四氢叶酸（THF）作为辅因子。在无细胞提取物中加入THF后,芝麻素代谢活性提高了350倍。天然SesA的分子量为150kDa。SesA的分子量计算为50385 Da,与SDS / PAGE测定的纯化酶分子量一致。结果表明SesA由三个相同亚基组成。
表1 SesA纯化
4、芝麻素代谢酶的鉴定
作者使用测序仪Hiseq2500分析序列信息，鉴定了一个1359个核苷酸的ORF,其中21个与上述N端序列相对应。推导的氨基酸序列鉴定了推测的叶酸结合结构域。
5、培养过程中芝麻素代谢的时间依赖性
在含有芝麻素作为唯一碳源的液体培养基中，酶的比活性在培养8小时后增加，随后在培养基中芝麻素减少蛋白质增加。相反,在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中，细胞按指数规律生长4小时，在培养期间未观察到芝麻素转化活性。此外,在液体培养基中，仅在添加芝麻素的情况下才能检测到芝麻素的转化活性。
6、免疫印迹分析
为了证实SesA表达与芝麻素代谢的相关性，在芝麻素存在的条件下诱导SesA，然后在有无0.1％芝麻素的培养条件下对提取物进行蛋白质印迹分析。仅在用芝麻素添加的无细胞提取物中观察到交叉反应带。并且只在芝麻素存在下生长的细胞中观察到SesA酶活性。
7、SesA的克隆和异源表达及SesA的生化特性
SesA编码基因的1.4kb区域插入表达载体后，并在大肠杆菌中产生了重组SesA进一步纯化发现重组SesA的特异活性与22号菌株中纯化的SesA几乎相同。作者研究了温度和pH值对SesA活性的影响。最佳反应温度和pH值分别低于40℃和pH 7.5-8.5。SesA在30°C以下和5.5-10.0的pH值范围内最为稳定。纯化的SesA的吸收光谱在280nm附近出现吸收最大值。
8、化学计量学
对SesA反应的化学计量进行了检验。通过HPLC和液相色谱（LC）/ MS / MS技术测定芝麻素，芝麻素单胞菌酚和叶酸等。我们在SesA反应混合物中检测到5,10-CH2-THF数量并没有发生变化。孵育30分钟后,5,10-CH2-THF升高至85Mm。
图3 芝麻素代谢途径及其反应机理
9、动力学分析
在1mM THF存在下使用不同浓度的芝麻素，发现该反应遵循Michaelis-Menten动力学。通过HPLC技术分析定量芝麻素单胞菌素,估算芝麻素的稳态动力学常数。非线性回归分析显示:Km = 0.032±0.005Mm,Vmax = 9.3±0.4(μmol·min-1·mg-1),kcat= 7.9±0.3s-1。
10、底物特异性
为了检测SesA的底物特异性,我们研究了图3中列出的化合物。通过LC / MS / MS和NMR分析确定产物结构。结果发现SesA活性对亚甲二氧基苯酚存在特异性。
11、SesA的突变分析
为了研究SesA的反应机制,我们构建了一组被单个氨基酸取代的突变体。发现SesA可以作用于木质素降解产物。基于酶的氨基酸序列比对,作者制备了三种SesA:D95A,E189A和Y221A的突变体。每种突变酶在大肠杆菌中表达并进一步纯化。使用与野生型SesA相同的方法测定酶活性。E189A和Y221A根本没有活性。与野生型酶相比，D95A衍生物的活性为40％。
本篇论文描述了分解芝麻的土壤微生物Sinomonassp. no. 22的分离和鉴定，以及对未知芝麻素修饰酶的纯化和表征。该酶具有独特的催化能力，作者阐明了这种酶的生化特性并提出了一种可能的反应机制。
本篇论文通过基础的试验方法很好的诠释了研究目的，为探究天然化合物的分解代谢和THF依赖性代谢途径提供新见解，同时为微生物芝麻素代谢和GcvT家族蛋白功能提供了新的参考意见。