科研 | Microbiome: 邻近植物产生的氰化物促进根乙烯介导根际微生物群落重建（国人作品）
编译：A国民少女，编辑：小菌菌、江舜尧。
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胁迫诱导的激素对于植物调节其微生物群落动态适应环境至关重要。尽管强调了植物激素乙烯在植物对异源特异性邻居检测的生理反应中的作用，但对于这种活化信号如何介导植物根际微生物群以增强植物适应性的了解还很少。在这里，本文使用了3年的花生（Arachis hypogaea L.），一种豆类和含氰化物的木薯（Manihotesculenta Crantz）间作和花生单作田间，盆栽和水培试验，以及外源乙烯施用和土壤培养实验，乙烯是氰化物衍生的信号，与相邻木薯的化学鉴定以及花生根际中的微生物重组有关。
论文ID
原名：Root ethylenemediates rhizosphere microbial community reconstruction when chemically detecting cyanide produced by neighbouring plants
译名：邻近植物产生的氰化物促进根乙烯介导根际微生物群落重建
期刊：Microbiome
IF：10.465
发表时间：2020.01.18
通讯作者：孙波
作者单位：中国科学院
实验设计
现场位于中国江西省鹰潭市的中国科学院红壤生态实验站（北纬28°15′，东经116°5′）。该地点位于海拔79 m a.s.l.，年平均气温为17.6°C，年平均降水量为1795mm。太阳总辐射为6514.2 MJ m-2 year-1，潜在蒸发量为1318 mm。无霜期为262天。土壤类型被分类为来源于第四纪红土的酸性壤土粘土（中国土壤分类学中的乌迪拉铁溶胶和联合国粮农组织分类系统中的铁甲酚），pH（水）为4.9。在土壤剖面的顶部25 cm，土壤有机碳（SOC）含量为10.23 g kg-1，总氮（TN）含量为0.90 g kg-1，有效磷（AP）含量为34.15 mg kg -1，并且有效钾（AK）含量为235.11 mg kg-1。
该实验于2013年至2016年进行，包括以下两种处理：（i）PC处理，花生（花生，豆科植物）和含氰化物的木薯进行PC处理（图1a）。每个处理重复四次。所有地块均接受120 kg·ha-1氮肥（尿素含46％N），90 kg·ha-1磷（过磷酸钙含12.5％P2O5）和135kg·ha-1 K2O（氯化钾含60.0％K2O）。每个单独的样地为10×8 m（长×宽），并且一个脊（宽度为0.4 m，高度为0.3 m）分隔相邻的样地。木薯茎（长20厘米）于4月15日至18日移植并于11月10日至15日收获，而花生于4月15日至20日播种并于8月15日至20日收获。在生长期，所有地块都要进行灌溉和除草。 2016年收获时确定了花生和木薯的产量。
田间土壤样品采集如下：（1）PC间作：距花生和木薯根部20 cm的花生根际土壤（PRi），木薯根际土壤（CRi）和块状土壤（BSi）；（2）PP单作：花生根际土壤（PRm）和疏松土壤（BSm）距离花生根20 cm（图1a）。紧紧附着在植物根部的土壤被定义为根际土壤。使用标准方法表征土壤化学性质（请参见附加文件1的方法S1中的详细信息）。在收获花生并将其储存在20°C进行土锅试验后，在PP处理中在1.5×2 m的区域内5-20 cm深度内的5–20 cm深度处另外收集了500 kg土壤。使用SPAD 502 plus（东京，日本），随机选择每种处理方法的16种花生植物（4个生物学重复×4个样地重复）以确定叶绿素含量（从植物顶部的单片叶子）就地测定叶绿素含量。测量植物高度和地上分支。在65°C干燥至恒重后测定植物生物量。所有土壤和植物样品均于2016年5月29日在花生开花期采集。
为了探索种间植物之间的地下化学相互作用是否会引发豆科植物根际微生物的重组，我们将含有氰化物的木薯植物与豆科植物花生一起种植，它们通常在亚热带地区共同种植。作者假设：
（1）花生根部的ET排放可以由邻近的木薯产生氰化物触发；
（2）类似于SA和JA，ET是一种挥发性激素，可以吸引特定的微生物种类并重塑植物根际的微生物群。
（3）重建的微生物群落可以改善花生的适应性。
为了评估这些假设，进行了为期3年的花生和木薯间作系统以及花生单作系统的田间试验以及相应的盆栽和水培试验。我们发现相邻的氰化物可能是诱导花生根ET排放的化学提示。使用来自野外和乙烯应用培养物的16S rRNA高通量测序分析，我们证明了ET调节了放线菌Catenulispora物种的丰度，该物种充当了间作花生根际中重组微生物网络的基石。重塑的微生物群落增加了花生根际中有效养分的积累。我们的研究结果揭示了焦点植物的根与微生物群之间发生了新颖的化学对话，建立了伙伴关系，当与异种植物邻居一起种植时，可以改善焦点植物的适应性。
结果
1 与木薯在田间共培养时的花生性状和根际营养特征
为了应对来自异种物种的生物胁迫，焦点植物显示出无数的塑性响应以优化适应性。在这里，花生-木薯间作系统中花生的产量（种子产量）（图1a）与单作系统中的相似，这是通过增加地上分枝的数量（P = 0.004），每单位豆荚的数量来实现的。植物和全果率（P <0.001）（表1）。然而，为了获得这些优势，花生降低了其生物量（P <0.001），特别是地上生物量（植物高度，P <0.001；地上生物量与地下生物量的比率，P<0.001）（表1）。间作花生个体的种子产量决定了后代的繁殖能力。当花生与邻近的木薯一起培养时，它在种子上的投入要多于地上组织。焦点植物群落中的这种生理变化与进化博弈论中身材矮小的植物的共存策略相似。
除了植物的生理变化外，根际养分的显着变化也引起了我们的注意（附表S1）。根际是植物从中获取资源的主要微区。花生个体的高产并没有导致根际营养供应的下降。相反，间作的花生根际土壤显示了改善的土壤理化特性，包括土壤有机碳（SOC），总氮（TN），氨氮（NH4 + -N），硝酸盐氮（NO3--N），总磷（TP）和有效磷（AP），与单作花生根际相比（P<0.05）（附表S1）。由于土壤微生物在根际养分释放和转化中起着核心作用，因此，间作和单作花生根际之间养分供应的差异可能暗示着两个系统中微生物群落的改变。
图1 间作和盆栽实验的间作和单作采样点示意图。
a：田间花生和木薯间作系统（i）和花生单作系统（ii）。间作组合包括一个2.0米的花生条（五行花生，行距为0.4 m）和一个0.4米的木薯条（一排木薯）。同一列内的套间距离为0.2 m。在单作系统中，行距为0.4 m，同一列内的行距为0.2 m。 CRi，BSi和PRi代表间作系统中的木薯根际土壤，块状土壤和花生根际土壤。 PRm和BSm代表单作系统中花生根际土壤和相应的散装土壤。
b：间作和单作盆栽实验的示意图。成对的植物在用丝网筛过滤器（红色虚线）分隔成小室的盆中一起生长。处理一，木薯单作；处理二，花生和木薯间作，处理三，花生单作；处理四，在花生中加入氰化物稀释液进行培养。与对照相比，花生加水培养。从相应的有色站点收集的根际和散装土壤用站点名称加小写字母“ s”表示；从站点收集的花生植物用站点名称加上小写字母“ p”表示
2 邻近的氰化物引发花生根乙烯的生产
在间作系统中，花生个体为种子生产分配了更多资源。这种生理反应总是通过植物激素信号来协调的。通过监测花生地下和地面组织中的植物激素水平（图1b），我们发现花生与木薯（Pip）间作会降低地下玉米蛋白和吲哚-3-乙酸（IAA）的浓度以及地上茉莉酸（JA）的浓度同时刺激地上赤霉素（GA）和根1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的产生（P <0.05）（图2a）。通过添加外源氰化物（处理IV中的CNp）可以模仿类似的响应（图2a）。与其他粮食作物不同，木薯中氰化物的产生水平取决于植物的品种和年龄，其根的外皮（2–5 mm）平均为577 mg kg-1f.wt。在这里，我们发现当两种物种共同培养时，从木薯根际（Cis）到花生根际（Pis）的土壤氰化物浓度形成一个陡峭的梯度，而花生根际（Pis）中氰化物的含量仍然是四倍。高于单一培养系统的花生根际（Pms和PBms，P <0.05）（图2b）。但是，花生组织中的氰化物浓度没有受到影响（图2c）。间作花生（Pip）中的根部ACC与土壤氰化物浓度相比，是对照（Cp）和单作花生（Pmp）的两倍。事实证明，添加外源氰化物可使花生根（CNp）的ACC浓度增加到与间作花生（Pip）相似的水平（图2a）。邻近木薯的氰化物对花生地下ACC的产量产生了积极影响。 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）是植物中乙烯（ET）的直接前体。花生根中较高的ACC对应较高的ET产量（图2d）。
Acera报告指出，某些土壤微生物具有将氰化物转化为氨基酸（如β-氰丙氨酸）的潜力，这些氨基酸可能会进一步代谢为ET。为消除土壤微生物对ET产生的干扰，使用定量实时PCR（qRT-PCR）跟踪与1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶（ACS）和1-氨基环丙烷-1-羧酸相关的基因表达酸性氧化酶（ACO）。间作和氰化物处理的花生根（Pip和CNp）中可能编码花生ACS和ACO蛋白的AhACS1，AhACO1和AhACO2转录物的表达明显较高（图2e，f）。当植物物种共存时，异源特异性化合物成为焦点植物识别竞争对手的化学线索。在这里，显示出来自邻近木薯的氰化物可响应邻近地下的花生激活ET产生。
作为中枢激素调节剂，乙烯（ET）触发了一系列生理适应。较高的ET导致植物在恶劣条件下对繁殖进行更多投资。异种特异性邻居的存在以植物生物量为代价最大化了花生种子的产量（表1）。这种优化的性能是农业的目标，但自然会受到抑制。
图2 土壤氰化物对根系乙烯合成和释放的影响。
a ：不同处理方式下，地上和地下花生组织中的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC，乙烯前体）浓度。
b：木薯和花生根际土壤及相应的块状土壤中氰化物的浓度。
c：花生根中的氰化物浓度。
d：用不同处理方法在花生根中生产乙烯（ET）。
通过qRT-PCR检测不同处理方法中花生根中ACS基因（AhACS1和AhACS2）的表达。通过qRT-PCR检测不同处理方法中花生根中ACO基因（AhACO1和AhACO2）的表达。
处理I：（木薯单作），Cms和CBms分别代表木薯根际和块状土壤。
处理II：（木薯和花生间作），顺式，PBIS和PI表示从木薯根际，本体土壤和根际花生土壤;点代表来自处理II的花生植物。
处理III:（花生单作），Pms和PBms代表花生根际和块状土壤； Pmp代表来自处理III的花生。
处理IV:（添加外源CN-的花生单作），CNp代表处理IV中的花生。控制（花生添加水）中，Cp表示从控制花生。土壤和植物氰化物的数据为一式三份的平均值+ SD；植物ACC浓度，ET生产和基因表达的数据是值+ SD为9次重复。根据Tukey的HSD测试的单向方差分析（ANOVA），带有不同字母的误差线表示存在显着差异（P <0.05）
3 乙烯化学调节根际微生物的多样性和组成
使用16SrRNA高通量测序，我们发现在木薯根际（CRi）中观察到最低的微生物Shannon和Chao1指数（P <0.05）（图3a，b），这可能是由于大量的木薯根部周围积聚氰化物（图2b）。据报道，高浓度的氰化物对微生物有毒。相反，间作系统（PRi）中的豌豆坚果根际显示出最高的微生物多样性（Shannon和Chao 1指数，P<0.05）（图3a，b）。这一发现与传统观点不同，因为根际微生物群落的多样性通常不如稀松土壤中的微生物群落。然而，在间作系统中，根微生物群通常表现出更高的多样性。根据微生物底物的喜好，植物的次生代谢产物可塑造根际微生物群落。在这里，相邻的木薯增加了花生地下部分的乙烯产量。为了确定增加的乙烯（ET）浓度是否直接改变了根际细菌的α多样性，我们在孵化实验中将外源乙烯应用于单作花生的根际土壤。我们发现，与未经处理的对照相比，在0.1–0.2 mM浓度水平下的乙烯处理显着增加了根际细菌α-多样性（Shannon和Chao 1指数，）（图3c，d）。总体而言，该领域中的酸性细菌，绿弯曲菌，放线菌，丙酸杆菌，扁平菌，β变形杆菌和γ变形杆菌以较高的相对丰度（平均相对丰度> 5％）存在（图3e）。有趣的是，在间作（PRi）和单作（PRm）系统中，花生根际之间只有放线菌和嗜酸菌的丰度有显着差异（P <0.001）。外源乙烯的添加可以模拟相同的效果：与对照相比，随着放线菌丰度的增加，添加乙烯的酸性细菌的丰度降低（P <0.05）（图3f）。为了进一步阐明田间土壤和根际微生物群落之间的群落更新差异，我们基于加权UniFrac指标，在主坐标分析（PCoA）中使用Bray-Curtis距离分析了β多样性（图4）。在花生单作系统中，根际（PRm）和块状土壤（BSm）是分开的（PANOSIM <0.01）（图4a），表明植物根际对细菌群落组装有明显的影响。但是，在邻近的木薯存在下，受氰化物影响的与土壤相关的大量细菌和花生根际细菌（BSi和PRi）似乎会聚，但仍与单一栽培种（PRm和BSm）和木薯根际细菌（CRi）分离）（PANOSIM<0.01）（图4a）。PRi和PRm之间的群落组成差异主要是由于酸性细菌的减少（图4b）。这与乙烯添加实验的结果一致，在乙烯添加实验中，浓度为0.1 mM和0.2 mM的ET导致放线菌被替换为沿着第一个坐标轴（PANOSIM <0.01）远离对照的放线菌（图4c，d ）。
图3 田间土壤微生物群落的α多样性和乙烯（ET）添加培养系统。
a , b:木薯和花生的根际土壤微生物区系的Shannon和Chao 1指数，以及间（蓝柱）和单作（粉柱）田间系统中相应的块状土壤。
c , d:不同ET浓度处理下微生物群的Shannon和Chao 1指数。
e , f:在田间和ET添加处理中微生物组成的磷化氢水平分布。
图4 基于Bray-Curtis距离的田间和乙烯加成孵育样品之间的加权UniFrac值的主坐标分析（PCoA）。
a:PCoA在现场的细菌群落组成。菌群清楚地分为四组，并用四个彩色的椭圆形标记。
b:根据PCoA，该领域细菌群落的显性OTU分数（相对丰度> 0.1％）。
c: PCoA在ET添加治疗中的细菌群落组成。
d:根据PCoA在ET添加处理中细菌群落的显性OTU分数（相对丰度> 0.1％）。
箭头指示约束因子的质心。圆圈大小代表细菌OTU的相对丰度，颜色分配给不同的门。种间试验中的CRi，木薯根际土壤； BSi，散装土壤，距花生和木薯植物20厘米； PRi，花生根际土壤的种间试验；种内实验中PRm，花生根际土壤； BSm，距花生植物20厘米的散土
4 乙烯通过影响特定微生物类群来调节根际网络
图5 间作和单作系统中的植物根际和相应的块状土壤网络。网络代表随机矩阵理论的共现模型，该模型来自每个站点的8个生物学重复，其中节点表示OTU，节点之间的边缘表示显着相关。绿色边缘表示两个单独节点之间的负协变，而红色边缘表示正协变。结节的颜色表示主要门（Proteobacteria的亚门）。在每个面板中，每个节点的大小与连接数（即节点度）成正比。标记为“ H1，H2和H3”的节点表示已识别的模块集线器，如下所示：H1，OTU1 Dokdonella； H2，OTU235Catenulispora；和H3，OTU73Pseudolabrys
图6 乙烯添加处理中基石相对丰度的变化及其与土壤有效养分含量的相关性。
a:外源乙烯加成试验的布局。将来自PRi处理的30克土壤放在灭菌瓶的底部。然后，将200 mL的0.1 mM，0.2 mM和0.5 mM的标准乙烯气体（乙烯和空气混合）注入玻璃瓶（V = 100 mL）中以完全替代空气。对于对照（0 mM），将注入气体替换为空气。注射后，立即将试管密封并在26°C下孵育7天，以检测微生物群落。
b:在不同乙烯水平处理下，OTU235（RPi网络中的模块中心H2）的相对丰度动态。根据单向方差分析（ANOVA），然后进行Tukey的HSD测试（P <0.05），具有不同颜色的列表示显着差异（P <0.05）。
c，d:在乙烯添加处理中OTU235丰度与有效养分（NH4 + -N和AP）之间存在显着关系（P <0.01）
结论
花生根中乙烯的产生可以由邻近的木薯植物的氰化物产生触发。这种气态信号通过改变放线菌种类Catenulisporasp.的丰度，改变了微生物的组成并重新组装了花生的共生网络，该物种成为间作花生根际的基石。重新组装的根际微生物群可为花生根提供更多可用养分，并支持种子生产。
我们的研究结果表明，根乙烯具有双重作用。它在感知种间邻居的生化线索中发挥作用，并且在介导根际微生物装配中具有调节功能，从而通过改善种子产量来增强植物的适应性。这一发现为开发新型间作策略提供了有希望的方向，该策略用于通过植物激素信号对根际微生物组进行靶向操作。
评论
邻近植物产生的氰化物是一种化学信号，可增加豆类花生根部乙烯的排放量。该植物激素信号导致特定放线菌物种的相对丰度增加，从而重塑了整个根际微生物网络。这导致必需营养素的利用率提高，植物分配转向增加种子产量，但以植物生物量为代价。我们的结果揭示了一种应力衍生植物信号的新功能，可以重塑根际微生物群落的组装，并建立战略性的植物-微生物伙伴关系，以增强农作物间作生态系统中的植物适应性。
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