科研 | Cell： 个体间肠道菌群的差异决定了人体对霍乱感染的耐药性
编译：Mina，编辑：小菌菌、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
肠道微生物组是胃肠道的常驻微生物群落。这个群落具有多样化性，但是人们对微生物多样性如何赋予肠道病原体抵抗力或敏感性的了解却很少。使用人类微生物组移植到几种感染动物模型中，研究表明关键的微生物组物种是依靠胆汁盐水解酶的活性塑造肠道的化学环境。该酶的活性通过降解激活毒力基因表达的胆汁盐牛磺胆酸盐，减少了主要的人类腹泻病原体霍乱弧菌的定殖。这些功能和种类的缺失会导致个人微生物组特异性感染量的增加。这些发现为通过调节肠道微生物组的结构和功能提出了霍乱弧菌感染个性化预防策略的新目标。
论文ID
Web results那不勒斯腓特烈二世大学
实验设计
结果
1 致病菌微生物易受霍乱弧菌定殖，微生物组移植可缓解病原体耐药性
由于霍乱流行地区经常发生传染性腹泻和营养不良，因此本研究假设在从多种环境损害肠道恢复的过程中观察到的独特的不良生物微生物组结构可能是霍乱易感性的复发窗口。根据这些宏基因组分析，使用人源分离株组装定义的肠道群落（图1A）。一种模型微生物组（CR）基于健康个体的宏基因组学调查，其特征为高分类学多样性，但通常包括拟杆菌，梭菌和蓝藻属的成员。另一个（DS）模型微生物组是在霍乱流行区（包括链球菌，粪肠球菌和大肠杆菌）发现的失调状态的特征。16S测序分析证实， CR菌群比失调的痢疾的微生物群更像健康的人类微生物群，而DS模型群更类似于霍乱结束时期微生物群（图1C和1D）。
图1.受腹泻诱导失调影响的模型人类肠道微生物群落结构
（A）定义的人类肠道群落。（B）健康的美国人类供体粪便微生物组的组成。（C）基于加权UniFrac距离的定义的和完整的人类肠道微生物群的主坐标分析，括号中显示了％方差。椭圆显示95％的置信区间。（D）加权UniFrac距离至腹泻结束时霍乱患者（左）和健康人类供体（右）的粪便样本的已定义人类模型微生物组的明确微生物
* p <0.05，**** p <0.0001，Mann-Whitney U -测试。箱线图显示四分位间距。
与接受DS微生物的动物相比，接受CR微生物组感染的小鼠对霍乱弧菌的定殖具有抗性（图2A和2B）。此外，通过混合CR和DS细菌可以恢复定植抗性，这表明通过微生物组修饰可以逆转敏感性（图2A和2B）。在混合组中，给小鼠施用了1：1的CR和DS混合物，与DS小鼠相比，霍乱弧菌水平显着降低，实际上在感染后2天降到了CR小鼠以下。
当将GF小鼠在引入霍乱弧菌之前用定义的群落定殖2周时，与简化的模型健康微生物组（SR）相比，研究还观察到了DS微生物组的定殖敏感性增加（图2C）。SR由代表主要在健康人类肠道中发现的主要系统进化谱系的三个物种组成。为了模拟尝试建立完整且密集的肠道菌群的微生物组，研究还引入了DS微生物10天，然后在感染霍乱弧菌之前4天用管饲SR微生物。在此混合组中，与DS克隆小鼠相比，病原体的定殖受到了强烈抑制，这表明微生物组修饰甚至可以用于恢复根深蒂固的不良生物群落，从而恢复定植抗性。
图2.肠道微生物组组成对霍乱弧菌的感染抗性的贡献
（A和B）在无菌的成年小鼠中霍乱弧菌定殖，这些小鼠在（A）粪便和（B）小肠中与霍乱弧菌共存了确定的模型群落，共4天感染后。（C）在具有确定的群落的GF成年小鼠中粪便霍乱弧菌定植2周，然后用霍乱弧菌进行管饲。混合：DS菌落定居10天，霍乱弧菌感染前4天再定殖SR微生物。（D）与模型群落和霍乱弧菌共同侵染的GF乳鼠的肠道霍乱弧菌定植。（E）与指定群落共同侵染的经抗生素处理的CD-1乳鼠的肠道霍乱弧菌定殖。（F）小肠中的16S基因丰度。（G）tcpA在具有模型人类微生物组的感染小鼠中的表达。（H）T6SS对经抗生素处理的CD-1幼仔中小肠定植的影响。
* p<0.05，** p<0.01，*** p <0.001（Mann-WhitneyU检验）。误差棒代表平均SEM。对于所有实验，n ＝ 6-12只动物。
然后，研究在具有不同群落的动物的粪便和小肠中感染期间剖析了肠道微生物组的结构（图3A，3C和3G）。在这些样本中，CR和DS群落是截然不同的，并且CR群落与健康的美国捐献者的完整粪便微生物组更为相似，而CR和DS的共同接种形成中间的微生物组。
图3.将CR模型人类微生物组添加到宿主DS微生物的小鼠中，可产生更接近完整人类健康志愿者粪便群落的群落结构
（AF）基于加权UniFrac距离的微生物群落多样性的主坐标分析（PCoA），方差％ 在每个轴的括号中显示。椭圆显示95％的置信区间。（A）与健康美国供者粪便样本相比，霍乱弧菌感染期间具有模型群落的GF小鼠粪便样本和小肠远端小肠的PCoA，（B）PC1位置和（C）所有成对加权UniFrac距离健康美国 供体粪便样本。（D）乳鼠中的模型群落和健康人类供体群落的PCoA，其中（E）PC1位置和（F）所有成对加权的UniFrac距离均与健康的美国供体粪便样本成对。
竞争性CR / DS移植会产生显性的CR样表型（图2E），而CR和DS的定殖在非弧菌感染动物中没有差异（图2F）。这种模式反映在16S测序数据中（图3D和3F）。在感染过程中，与具有DS微生物的动物相比，接受CR微生物的幼崽的群落结构非常不同，并且接受混合接种物（CR + DS）的动物与CR小鼠极为相似。
最近的研究表明，杀死鼠共生大肠杆菌的VI型分泌系统（T6SS）的作用是驱动乳鼠感染中的毒力增加。由于DS模型包含大肠杆菌（尽管菌株不同），因此我们系统中测试了T6SS对霍乱弧菌定植和大肠杆菌水平的影响。与野生型霍乱弧菌相比，在经过抗生素清除的哺乳小鼠中，T6SSΔvasK突变体的定居能力不足（图2H）。但是，T6SS活性并未显着改变共同接种的抗链霉素K12大肠杆菌的水平，并且我们在小肠的DS和Mix（DS + CR）群落中观察到了可比水平的大肠杆菌（图3G）。这些差异可能是大肠杆菌菌株特异的，或者是由于先前的T6SS研究中使用的霍乱弧菌水平高得多。
综上所述，提高CR / SR微生物的定植抗性的机制在于霍乱弧菌毒力基因表达的T6SS系统的操控。
3 肠道菌群对病原体定殖抗性的个体差异
在乳鼠中建立的微生物组移植系统使我们能够筛查从健康的成年志愿者收集的许多完整的人类粪便微生物群（这些志愿者没有营养不良或近期使用抗生素或腹泻对霍乱弧菌的影响）（图1B）。这些完整的粪便群落在分类学上与CR相似，但在移植后原始微生物含量和群落结构上都没有DS微生物群落（图3D 3F）。这不足为奇，因为在这些样本中，CR模型社区代表了属水平多样性多达73％，而DS社区的成员仅代表了总数的不到1％（表S4）。
我们将粪便浆液标准化，并将这些样品移植到抗生素治疗的霍乱弧菌的乳鼠中（图4），对霍乱弧菌的定殖产生了显着不同的影响，尽管这些粪便群落以相似的效率和密度定居了乳鼠（图2F）。我们观察到霍乱弧菌定殖的范围约为1.5-log10（取决于人类供体）（图4），表明基于个体肠道微生物组结构的感染结局差异很大。孟加拉国较高的基础微生物组多样性（图1C）表明，流行地区人际抗感染能力的变异可能更高。
4 微生物组成员随机分配的管道确定与霍乱弧菌感染结果一致相关的共生物种
在相互拮抗的土著菌群中观察到的入侵成功率较低，可能是由于入侵者受到的直接抑制水平较高和/或入侵者和土著菌群成员之间的资源生态位重叠。我们发现，直接的病原菌抑制和高资源生态位重叠降低了体外和体内的入侵者密度，而只有直接的病原菌抑制显著降低了疾病发生率（表1）。直接病原菌抑制与预测和观察到的平均便利化强度呈负相关，表明拮抗性多物种群落对入侵者的抑制作用更强（图S8）。解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和F. johnsoniae对体外和体内病原菌密度有强烈的负作用（表S7）。然而，只有解淀粉芽孢杆菌对疾病的发病率有显著的负作用，而C. daecheongense对疾病的发病率有轻微的正作用（表S7）。总之，这些结果表明，在体外和体内，成对的土著菌群相互作用可以预测多物种菌群情况下的病原菌入侵率，这些影响主要与直接病原菌的抑制有关。
我们假设最能在DS群落中定植肠道的CR物种可能是预防感染的原因，因为将CR微生物移植到DS群落中可减少霍乱弧菌的定殖。因此，我们在具有混合CR + DS群落的GF动物中检查了霍乱弧菌感染期间的肠道微生物组结构（图3A和3G）。小肠中的CR群落与粪便中的CR群落截然不同，但是具有该群落的所有动物始终被Blautia和Bacteroides物种定殖。DS社区在粪便和小肠中是一致的，并且以链球菌为主。粪便数据不能推广到其他肠室，这表明粪便取样研究可能掩盖了近端胃肠道发病机制的重要差异。
在小肠中，黑麦芽孢杆菌（B. obeum）在致癌的CR + DS和仅CR的动物中保持其相对丰度（图3H），这表明它可能在CR感染抗性中发挥作用，并将此表型传递给DS动物。但是，鉴于人类基本的人际差异，这些发现缺乏普遍性；取代一种不良生物微生物组并抵抗霍乱弧菌定殖的能力在不同的个体和微生物群落中可能并不具有代表性。为了在许多不同的微生物组环境中鉴定弧菌拮抗微生物，我们从CR和DS菌株中提取了随机，独特的5元组合（图5A和5B），并在经抗生素清除的哺乳动物中建立了这些细菌的OD600标准化混合物，并且没有弧菌感染。我们认为，存在/不存在或霍乱弧菌定植丰度在许多不同菌落中始终相关的物种将是抗弧菌干预的极好的推定目标。
我们确定了与多种微生物组组合中的病原体水平一致相关的几种物种。较高的黑麦芽孢杆菌水平与霍乱弧菌的定殖量显着相关（图5C），但与霍乱弧菌的丰度没有直接关系。这与混合CR / DS微生物组对感染的影响是一致的。在DS小肠中始终存在的B. obeum，但并不是高水平即可影响霍乱弧菌。在众多随机群落中都观察到了这种效应，这表明在许多肠道菌群中，大肠双歧杆菌对霍乱弧菌感染的抑制活性可能被广泛推广。除了存在双歧杆菌以外，基于是否存在SR或CR物种，我们没有发现对霍乱弧菌定植有统计学意义的影响。相比之下，DS微生物（链球菌，粪肠球菌和大肠杆菌）感染期间的水平与更高的弧菌水平均呈正相关，并显着相关（图5D）。在结合有黑麦芽孢杆菌和嗜热链球菌的小鼠中，霍乱弧菌的定殖与包括黑麦芽孢杆菌但不含链球菌的组合的小鼠相当，再次支持了以下观察结果：黑麦芽孢杆菌对发病机理的影响在不同的微生物群落中占主导地位（图5C）。
5 导致霍乱弧菌致病性基因表达的肠道信号被B. obeum消除
在确定了霍乱弧菌感染抗性的候选驱动因素后，我们开始寻找这些作用的分子机制。宿主和一些共生的微生物线索在体内调节霍乱弧菌的基因表达。先前的研究已经确定了产双歧杆菌的AI-2自动诱导剂在感染过程中下调TCP生物发生基因表达的作用。与此发现一致，我们观察到小鼠感染含有小球藻的微生物群后tcpA表达降低（图2G）。可以使用霍乱弧菌与小鼠肠道组织的微需氧/厌氧生长体外模拟毒性基因调控的体内条件。我们取乳鼠肠匀浆，并与霍乱弧菌lacZ：PtcpA -sh ble zeocin抗性报告基因厌氧孵育。如预期的那样，肠匀浆诱导tcpA表达，而用匀浆双歧杆菌预处理肠匀浆则消融了tcpA诱导（图6A）。作为对照，我们煮沸了已经与黑麦芽孢杆菌培养物一起孵育的肠匀浆，以去除热不稳定的AI-2。令人惊讶的是，与单独煮沸的匀浆或与唾液链球菌孵育后煮沸的匀浆相比，用B.obeum孵育的匀浆即使在煮沸后仍不能诱导tcpA(图6A)。这些数据表明，双歧杆菌可以消耗肠道内的毒力激活信号并产生毒力抑制信号。
6 胆汁盐牛磺胆酸盐起有效的毒力基因激活剂作用，且在健康的肠道菌群中更易被共生微生物降解
小肠中存在的一种耐热分子是胆汁。在人和小鼠中，胆汁酸是由胆固醇在肝脏中合成的，并储存在胆囊中。这些初级胆汁酸然后被分泌到十二指肠，在那里它们通常以其钠盐的形式起作用，以帮助膳食脂肪的乳化和吸收。超过95％的分泌胆汁酸被回肠末端主动吸收，并通过称为肠肝循环的过程被送回肝脏。许多先前的研究集中于从各种来源（包括反刍动物）中提取的粗提取物，这些提取物含有定义不明确的胆汁分子混合物。分泌到小肠中的人胆汁酸主要与牛磺酸（牛磺胆酸/牛磺胆酸钠）和甘氨酸（乙醇酸/甘胆酸钠）结合，而与牛磺酸结合的形式在小鼠中占主导地位。共生微生物作用对胆汁酸代谢很重要；胆汁盐水解酶能够从小肠分泌的胆汁酸中去除结合的氨基酸，例如将甘醇酸（GC）和牛磺胆酸（TC）转化为胆酸盐/胆酸（CA）。
先前的研究表明，TC（牛磺胆酸盐）是人和小鼠中最丰富的胆汁分子之一，可以诱导tcp并过滤灭菌所得的上清液，并测量了它们诱导PtcpA的能力（图6C）。我们观察到这些菌株影响TC毒力诱导能力的巨大差异，CR / SR微生物群成员通常能够更好地阻止tcp活化。消融TC介导的tcp表达的诱导能力在属水平上有所不同，与其他双歧杆菌相比，Blautia不能影响tcp对TC的诱导，而婴儿链球菌能够处理TC。在SR物种中，B.vulgatus（但不是C. scindens）表现出有效的TC处理。由于SR在很大程度上概括了CR的定植抗性表型，而普通短小芽孢杆菌在体外表现出对TC的高活性，因此我们想研究在整个远端小肠中，短小芽孢杆菌和普通小芽孢杆菌对TC的相对贡献。与GF小鼠相比，我们定植了具有CR成员或没有B. obeum的CR物种的成年GF小鼠，并在定殖后2天测量了小肠远端三分之一的TC和CA（图S4A）。正如预期的那样，由于缺乏微生物bsh，GF远端小肠显示出较高的TC / CA比，而CR微生物的存在有效地处理了TC / CA，从而产生了较低的TC / CA比。引人注目的是，尽管在GF动物中有更多TC的趋势，但去除B. obeum可使远端小肠中的TC / CA比值恢复到与GF动物无统计学差异。这表明，尽管其他CR生物体也可以促进对CA的TC加工，但是，B. obeum特别适合于控制远端小肠中这种胆汁酸的水平。这与我们的发现是一致的，即黑麦芽孢杆菌可有效地定居在小肠中（图3和5），而寻常小芽孢杆菌和黑麦芽孢杆菌的存在并不能显着提高微生物组排除霍乱弧菌的能力。
图5.识别霍乱弧菌定植和对霍乱弧菌定植的敏感性的无偏组合策略
（A）组合策略。（B）使用CR / DS成员随机产生的5种微生物组实施方案（左）。右侧显示了含有定义的微生物组实施方案的抗生素处理的乳鼠的霍乱弧菌感染结果。（C）在带有单独或组合含有黑麦芽孢杆菌或链球菌物种的群落的乳鼠中的平均霍乱弧菌定植。跨实验将数据归一化为感染后菌落形成单位（CFU）的霍乱弧菌。（D）随机微生物组中DS成员物种的丰度与感染后霍乱弧菌的丰度相关。点代表接受不同微生物组实施方案的小鼠。
* p<0.05（Mann-WhitneyU检验）。误差线代表平均SEM
7 B. obeum诱导的胆汁盐水解酶能够降解肠道中的毒力激活信号
通过在大肠杆菌中的PLtet-O1启动子克隆该基因，本实验表达了B. obeum的 bsh RUMOBE_000028。与纯TC溶液（图6D）和肠匀浆（图6E）中的等基因载体对照相比，该bshC菌株有效降低了TC和tcp活化水平。值得注意的是，考虑到双歧杆菌对弧菌抗性的主要作用，在存在唾液链球菌的情况下，双歧杆菌或bshC的纯培养物可降低TC的tcp活化（图6D）和肠匀浆中TC的水平（图6E）。这种霍乱双歧杆菌酶的活性能够在体内影响霍乱弧菌，因为霍乱弧菌无法像使用载体对照的小鼠一样有效地定殖有bshC的小鼠（图6F）。
8 人类肠道微生物群落中的胆汁盐水解酶水平与霍乱弧菌感染结果相关
因为Blautia属的物种在体外表现出bsh活性的差异，并且与霍乱患者和未感染的家庭成员相关，所以本实验专门从人粪便样品中通过实时PCR提取总B.obeum中的bsh基因水平。在这些复杂的粪便混合物中，这也可作为特定功能测量黑麦芽孢杆菌丰度的方法。我们发现，与霍乱弧菌定植程度更高相关的社区具有较低的水平的霍乱弧菌bsh（图7C），这表明，霍乱弧菌的丰度，尤其是bsh的活性与对霍乱弧菌感染的抵抗力有关。
图7.人类样品中的土壤双歧杆菌bsh酶水平与感染结果相关，并且可以独立调节霍乱弧菌定植
（A）霍乱患者粪便微生物群宏基因组测序前系统型1 bsh酶水平（腹泻（d0）） ）和抗生素后（腹泻+ abx）治疗的水平，与孟加拉国的健康成年人相比。（B）在125mM TC溶液中胆汁水平的质谱测量，所述TC与指示的培养的人类粪便群落在体外孵育。（C）与携带人供体微生物群的经抗生素清除的哺乳类动物的霍乱弧菌定殖相比，用无霍乱弧菌的复杂人粪便样本定植的经抗生素清除的乳汁CD-1小鼠肠道中的黑麦芽孢杆菌水平。
** p <0.01，*** p <0.001（MannWhitney U检验）。误差线代表平均SEM
结论
研究结果表明，人类肠道微生物组的变异是霍乱弧菌感染风险的重要因素，可以通过引入对肠道霍乱弧菌具有多种分子作用的人类肠道来调节，这能够影响两种致病因子激活水平和在感染部位抑制病毒的信号。这表明靶向的微生物组修饰可能是预防霍乱的有效的靶标。
你可能还喜欢