腺相关病毒包装原理及步骤

采用第2代重组腺相关病毒包装系统制备病毒颗粒。该包装系统包含3个质粒和一株包装细胞株。

1）1个转移质粒：含有两侧有AAVITR序列的转基因表达盒子。

2）1个Rep-cap表达质粒：表达Rep和Cap两个基因。

3）1个辅助质粒：包含来自腺病毒的一些基因（E4、E2a和VA）。这些腺病毒的基因可以促进AAV基因组的复制。

4）1株含有腺病毒E1基因的293细胞。

野生型腺相关病毒基因组是一条长约4.7 kb的线性单链DNA（ssDNA）分子。基因组两末端各有一个145 nt长的Inverted Terminal Repeat (ITR)，ITR序列是对称的，自己能形成发夹结构。病毒感染细胞后，释放出单链病毒基因组，末端发夹结构促使腺相关病毒以单链基因组为模板复制互补链，形成双链DNA。野生型病毒只表达2个基因：rep (replication) 和cap (capsid)，Rep编码非结构蛋白，Cap编码结构蛋白。腺相关病毒基因组不编码polymerase，基因组DNA的复制需要用到宿主细胞表达的polymerase。将基因组上的Rep和Cap基因删除，克隆到质粒上，然后将目的基因克隆在两个ITR之间，这个质粒就成为转移质粒。而Rep和Cap基因被克隆到另外一个质粒上，成为Rep-cap表达质粒。除了Rep-cap表达质粒，还需要一个辅助质粒。这个辅助质粒表达腺病毒的一些基因（E4、E2a和VA），这些腺病毒基因可以促进AAV基因组的复制。除了3个质粒外，腺相关病毒包装系统还需要一株表达腺病毒E1基因的293细胞。

每次包装重组腺相关病毒，辅助质粒均固定不变，只要血清型不变，Rep-cap质粒也是相对固定，变化的是编码目的基因的转移质粒。