NanoDisk-MS：一种结核病快速准确诊断和治疗监测的创新技术
结核病是威胁人类健康的重大疾病。2030年终结全球结核病流行是联合国可持续发展目标之一。然而，WHO监测数据显示，2015年全球活动性结核新发病例1040万人，结核病死亡180万人，与上一年度相比，新发病例、死亡病例数均不降反升[1]。由于缺乏有效的疫苗、耐药菌株的出现、诊断技术性能不佳、基于培养技术的治疗评价耗时长，结核分枝杆菌这种地球上迄今为止最为成功的病原体[2]，使人类在终结结核病流行的战役中面临严峻挑战。
控制结核病疫情的关键是早期诊断和有效治疗。目前，临床上可供选择的诊断技术均存在一定的局限性。广泛应用于初诊患者的抗酸杆菌涂片显微镜检查技术，除敏感性无法满足要求外，还受标本采集的影响，对于不咳痰的肺结核患者或取材困难的肺外结核患者难以诊断。培养技术是目前结核病诊断的“金标准”，虽可以获得结核分枝杆菌用于药物敏感性试验，但存在与显微镜检查技术同样的不足，且耗时达数周之久，严重影响了该技术在结核病诊断方面的实际应用价值[3]。
以GeneXpert为代表的分子生物学技术检测结核分枝杆菌特异性高，且可以在2小时内报告是否为结核分枝杆菌感染及利福平耐药。然而，该法不能区分活菌和死菌，且对于菌阴肺结核以及某些肺外结核的检测敏感性低[4]。传统的免疫学方法如结核菌素皮肤试验（TST）因受卡介苗及环境分枝杆菌的影响，在诊断结核分枝杆菌感染时特异性低。新一代免疫学技术，如Gamma-干扰素释放试验（IGRA），虽然不受卡介苗及大多数环境分枝杆菌的影响，但不能区分活动性与潜伏性结核感染，对活动性结核的诊断特异性差，这在结核病高负担国家尤为突出[5]。因此，迫切需要研发快速、无创、可定量、敏感性高、特异性好，尤其是不基于痰标本的结核病诊断新技术，以有效诊断各类人群活动性肺结核，以及快速评估临床治疗效果以应对逐渐增多的耐药结核菌感染。
令人兴奋的是，最近美国亚利桑那州立大学的胡晔等在PNAS上发表文章，公布了一项将抗体标记、能量聚集纳米盘与高通量质谱技术相结合的方法（NanoDisk-MS，纳米盘-质谱技术）用以检测经消化的血清样本中结核特异性抗原肽。该创新技术灵敏度、特异性高，能够快速、定量检测外周血标本诊断活动性结核分枝杆菌感染并监测抗结核治疗效果[6]。NEJM Journal Watch 也对该研究进行了评论报道（点击“阅读原文”：《纳米微粒可能改善结核分枝杆菌感染的诊断》）。
NanoDisk-MS技术设计精巧，检测性能优越。作者创新性地利用硅纳米材料稳定、易于修饰，孔隙度、吸光度和比表面积可控的特性，使其与特异性10 kDa培养滤液蛋白（10-kDa culture filtrate protein，CFP-10）和6 kDa早期分泌抗原靶点（6-kDa early secretory antigenic target，ESAT-6）抗体相结合，充分富集标本中的目标抗原。利用强选择性的重组胰蛋白酶消化血清，消除标本中非结核分枝杆菌（NTM）表达的同源性抗原的干扰以及宿主蛋白对目标抗原的表位遮蔽效应，完全释放结核分枝杆菌特异性的ESAT-6和CFP-10抗原肽(由于感染初期结核分枝杆菌即分泌特异性的ESAT-6和CFP-10抗原，故血清ESAT-6和CFP-10抗原浓度可以用于活动性结核的诊断)，并借助质谱技术高效、快速、高通量的特性，加之纳米材料增强质谱信号强度，实现结核病的快速、准确检测，且灵敏度高，结果准确，重复性好。其优越的检测性能表现为：结核特异性抗原肽的检出线和定量检出线，CFP-10分别为50 pM和200 pM 、ESAT-6为200 pM和500 pM；批内、批间变异系数分别为14%～22%、16%～23%；准确度约74%（1 nM）～90%（20 nM）。在此基础上，作者独具匠心地在反应体系中加入稳定同位素内标以减少误差和干扰，通过标准曲线的建立，定量检测外周血中结核抗原肽含量，以血液中结核抗原肽的浓度变化反映抗结核治疗的有效性，实现对患者抗结核治疗效果的监测和评价。此外，作者还精心设计了标本的处理过程，采用微波辅助酶切技术将血清消化时间由过夜缩短至20 min，使标本处理到结果报告时间大为缩短，实现了快速诊断。
NanoDisk-MS技术快速、定量检测活动性结核患者特异性血清标志物，克服了现有技术的缺陷，诊断性能显著提高，尤其对HIV阳性患者活动性肺结核、肺外结核等低菌量感染诊断性能突出。盲样分析显示，在HIV阳性患者中，NanoDisk-MS技术检测培养阳性的活动性肺结核、肺外结核阳性率分别为91.3%（21/23）、92.3%（12/13），培养阴性的活动性肺结核、肺外结核阳性率分别达到82.4%（14/17）、75.0%（6/8）；涂片阳性和阴性患者的敏感性分别为100%和84.3%。对TB阴性/HIV阳性者检测显示，特异性为89.7%（26/29）。由此可见，NanoDisk-MS技术对HIV阳性结核的诊断性能显著优于结核培养技术诊断肺结核（57.3%，23/40）和肺外结核（61.9%，13/21），甚至优于Xpert MTB/RIF技术。有文献报道，在HIV阳性患者中，结核培养阳性肺结核患者Xpert MTB/RIF检测敏感性为86.2%（50/58），结核培养阳性和阴性肺外结核患者分别为67.7%（21/31）和29.4%（5/17）[7]。
随着耐药结核菌感染的出现和上升，快速、准确地评价抗结核治疗效果极为重要，然而，这却是一个困扰临床，尚未解决的难题。目前，医生往往根据痰涂片抗酸染色的结果和肺部影像学改变对肺结核患者治疗效果进行评估，这些方法缺乏准确性和敏感性，不能及时反映患者对抗结核药物的反应性及治疗效果。NanoDisk-MS技术通过定量检测结核病患者治疗过程中结核菌抗原肽的浓度变化，实现准确、敏感、及时评价治疗效果。研究显示，治疗过程中绝大部分患者外周血结核菌抗原肽浓度持续降低，直至达到抗原清除的水平。
由于采用非侵入性的外周血进行结核病诊断和治疗监测，加之所用检测设备MALDI-TOF MS为已在实验室应用于微生物鉴定的质谱仪，因此，NanoDisk-MS技术易于临床转化和推广。
值得注意的是，胡晔等对NanoDisk-MS技术应用于结核病的诊断和治疗监测的性能研究是在结核低负担国家进行的，而且样本量较小。此外，由于TST技术容易受卡介苗接种的影响，研究中潜伏性结核感染入组人群的诊断准确性可能存在偏倚。因此，有必要在结核高负担国家，开展大规模、多中心研究，全面评估NanoDisk-MS技术在结核病快速、准确诊断和治疗监测中的应用，并且利用NanoDisk-MS技术定量检测的优势，获得区分活动性与潜伏性结核感染的临界值，观察结核抗原肽浓度变化及其与临床表现和治疗结果之间的关系。
概括而言，NanoDisk-MS技术的特点为：1）标本为少量（100 µL血清）、非侵入性采集的外周血；2）不需要分离培养技术；3）对于常需要实施包括侵入性检查在内的多种检测的活动性肺结核、肺外结核、培养阴性结核、HIV感染的结核患者诊断敏感性、特异性高；4）直接定量检测结核分枝杆菌抗原以快速监测抗结核治疗效果；5）所用检测设备MALDI-TOF MS具有高效、快速、高通量的特性；6）所用设备为已经批准用于微生物鉴定的质谱仪（MALDI-TOF MS）。NanoDisk-MS的技术特点满足WHO对非侵入性结核诊断技术的要求[8]，此技术也可为其他感染性疾病的诊断提供新思路，尤其是常规免疫测定诊断性能不佳的疾病。
期待NanoDisk-MS这一创新技术早日实现临床转化，并广泛应用，助力2030年终结全球结核病流行，实现联合国抵御结核的可持续发展目标。
撰文：汪峰，孙自镛 （华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科）
[1] World Health Organization. Global tuberculosis report. 2016. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250441/1/9789241565394-eng.pdf (accessed in May 2017).
[2] Kaufmann SH. EFIS lecture. Immune response to tuberculosis: How to control the most successful pathogen on earth. Immunol Lett 2016;175:50-57.
[3] Dunlap NE, Bass J, Fujiwara P. et al. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. Am J Resp Crit Care 2000;161:1376-1395.
[4] World Health Organization . XpertMTB/RIF: WHO Policy Update and Implementation Manual. 2014. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/112469/1/9789241506700_eng.pdf (accessed in May 2017).
[5] WHO. Use of tuberculosis interferon-gamma release assays (IGRAs) in low- and middle-income countries: policy statement. WHO, 2011. Available at: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/44759/1/9789241502672_eng.pdf
[6] Chang L, Zhen Z, Ye H. et al. Quantification of circulating Mycobacterium tuberculosis antigen peptides allows rapid diagnosis of active disease and treatment monitoring. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017; 114(15):3969-3974.
[7] Zeka AN, Tasbakan S, Cavusoglu C. Evaluation of the GeneXpert MTB/RIF assay for rapid diagnosis of tuberculosis and detection of rifampin resistance in pulmonary and extrapulmonary specimens. J Clin Microbiol . 2011; 49(12):4138-4141.
[8] World Health Organization. High-Priority Target Product Profiles for New Tuberculosis Diagnostics: Report of a Consensus Meeting. 2014. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/135617/1/WHO_HTM_TB_2014.18_eng.pdf (accessed in May 2017).