科济生物展示CAR-Claudin18.2-T数据及最新文献

第一部分 新闻事件

第二部分 最新文章

第三部分 IMAB362介绍

第一部分 新闻事件

BOSTON, Sept. 8, 2018 /PRNewswire/ -- CARsgen Therapeutics, a clinical-stage company committed to developing Chimeric Antigen Receptor T cell therapies for cancer, presented its preliminary clinical data of a first-in-class CAR-Claudin18.2 T cell trial for treatment of pancreatic and gastric cancer at 2018 CAR-TCR Summit in Boston.

科济生物在波士顿召开的2018年第4次CAR-TCR会议上展示靶向Claudin18.2的CAR-T治疗胰腺癌和胃癌的研究数据。

Among 12 relapsed/refractory patients enrolled, 8 have been observed with tumor regression of different degree. In an improved sub-cohort of 6 subjects, 5 patients showed objective response including 1 patient of complete response per RECIST 1.1 criteria.

在入组的12名复发或者难治患者中，有8人观察到不同程度的肿瘤消退；而在1个改进的治疗亚组队列中，基于RECIST 1.1 评估标准，6名患者有5人观察到缓解，其中1人完全缓解。

第二部分 李博士团队最新文章

2018年9月6日，李宗海博士团队的CAR-Claudin18.2-T治疗胃癌的体内和体外研究数据发表在JNCI （J Natl Cancer Inst），下面简单介绍。

背景

胃癌是全球第三大致死肿瘤，每年新发100万人左右，尽管手术和化疗有了一定进展，但是5年生存率5-20%，整体上OS~10个月左右。亟需新的治疗。

CAR-T已经在血液肿瘤中大放异彩，但是在实体瘤中还没有获得突破性的疾病控制。尽管如此，在靶向IL13Ra2和HER 2的CAR-T的一些早期临床研究中发现了令人鼓舞的抗肿瘤活性，预示着CAR-T依旧是实体瘤的潜在治疗方法。

CLDN18.2是claudin-18在胃组织特异的异构体，靶向CLDN18.2的单抗IMAB362被证明对正常组织没有明显毒性，而在胃癌患者中的整体客观缓解率10%左右，预示着CLDN18.2是胃癌及其它CLDN18.2阳性肿瘤的潜在靶点。之前尚无靶向CLDN18.2的CAR-T研究，本文介绍了研发及体外和体内的数据。

材料及方法

  • 体外细胞毒性检测：不同细胞与改造的T细胞按比例混孵18h后，测定上清人乳酸脱氢酶。

  • 细胞因子释放检测：ELISA

  • 体内抗肿瘤研究：CLDN18.2–CAR T的有效性研究用的胃肿瘤的PDX模型，小鼠携带肿瘤的大小100mm^3左右，随机分配到空白组和治疗组（每组6-7只）：未转导的T细胞（UTD组）和CLDN18.2–CAR T细胞。小鼠体重和肿瘤大小每周测量2次。

  • 统计：体外数据用双尾t检验确定统计差异，双因素或单因素方法分析用于体内数据。

结果

1 靶向CLDN18.2抗体的开发：

  • 首先开发了特异性靶向CLDN18.2而非CLDN18.1的鼠源单抗8E5，随后用CDR移植的方法进行了人源化。人源化的8E5(hu8E5) scFv对CLDN18.2阳性293T细胞的EC50值和8E5 scFv接近：31.81nM vs 49.19nM。

  • 随后进行了稳定性改造，最终产生的标注hu8E5-2I有着最高的单体比例，相比最初hu8E5：86.5% vs 74.4%，而hu8E5-2I的EC50 6.4nM。

  • 而结合实验中，8E5和hu8E5-2I对人、鼠和猕猴的CLDN18.2都有很强的结合力，同时并不结合CLDN18.1，说明了靶向CLDN18.2的特异性很好。

2 CLDN18.2的表达谱

  • 评估了CLDN18.2在人24个正常组织样本的表达情况，但是只在胃组织中检测到。而在补充材料中（图略），CLDN18.2在75个样本中肿瘤组织周边的正常胃组织也是高表达。

  • 在胃癌组织中，在86.7%的样本中检测到CLDN18.2表达并在73.3%的样本中是高表达（≥2个强度），同时可以看出CLDN18.2在胃癌组织中的表达是均匀的。

  • 而在转移病灶中，77.4和61.3的样本检测出CLDN18.2的表达和高表达，可以看出转移性病灶的结果和原发性胃癌样本的一致。

3 构造特异性靶向GLDN18.2的CAR-T细胞

  • 构建了一系列的慢病毒载体编码不同的CAR(hu8E5–28Z、hu8E5-BBZ 和 hu8E5–2I-28Z)，包括靶向CLDN18.2的scFv、CD28或CD137(41BB)和CD3ζ的胞内信号结构域，其余细节如下图。

  • 随后用这些编码CAR的慢病毒转染T细胞，而mock T细胞则用编码eGFP慢病毒转染，最终mock、hu8E5–28Z、hu8E5-BBZ和hu8E5–2I-28Z的转导效率分别70.1%、55.2%、45.8%和62.9%。

4 CLDN18.2 CAR-T细胞在体外的毒作用

  • 转入了hu8E5-28Z和hu8E5-BBZ CAR的T细胞在体外都能裂解CLDN18.2阳性的细胞，但不能裂解CLDN18.2阴性细胞，同时mock T细胞不能裂解任何一种细胞。下图中，上列三幅图为阴性细胞，下列三幅为阳性细胞，细胞被裂解后检测到LDH活性，故只有CAR-T细胞能在CLDN18.2阳性的细胞中检测到活性。

  • 需要指出的是，在CLDN18.2阳性的293T细胞中，hu8E5–28Z T细胞的毒作用是高于hu8E5-BBZ T细胞。而和hu8E5–28Z类似，hu8E5–2I-28Z T 细胞也能特异性的裂解CLDN18.2过表达的细胞，而且强度相近。以上表明这些CAR-T有着内在的靶点依赖性的细胞毒活性。

5 细胞因子产生

  • 在和CLDN18.2阳性的细胞孵育后，hu8E5–28Z 和 hu8E5–2I-28Z 这些CAR-T细胞产生的TNF-a、IL-2和IFN-c等细胞因子的量远远大于mock T细胞，相反和CLDN18.2阴性的细胞孵育后没有检测到这些细胞因子的产生。

  • 细分来看，hu8E5–2I-28Z T细胞产生的TNF-a和IFN-γ的量高于hu8E5-28Z。

  • 我们知道293T属于正常细胞，而BGC和AGS属于两种胃癌细胞株。本次研究中hu8E5–2I-28Z和胃癌细胞孵育后分泌的IL-2也是高于hu8E5-28Z，但是在和293T细胞孵育后两者差异不显著(p=0.88)。

6 CLDN18.2 CAR-T细胞的体内数据

  • UTD（未转导组）和CLDN18.2 CAR-T细胞分别处理皮下注射了胃癌组织的小鼠（由转染了CLDN18.2的BGC-823细胞形成）。

  • 接种肿瘤29天以后，hu8E5–28Z和hu8E5–2I-28Z T细胞处理的肿瘤大小分别【下面结果的数字格式：mean(SD) unit】118.0(108.6)mm^3和75.5(118.7)mm^3，远远小于UTD组的73.8(206.3)mm^3，这种变化有显著差异：hu8E5–28Z vs UTD: P < .001；hu8E5–2I-28Z vs UTD: P < .001。

  • hu8E5–28Z和hu8E5–2I-28Z T细胞处理的肿瘤重量分别0.1(0.2) g和0.1(0.1)g，也远远小于UTD组的肿瘤重量0.5(0.2)g，同样这里的差异在统计学上也是显著的：hu8E5–28Z vs UTD: P < .001；hu8E5–2I-28Z vs UTD: P < .001。

  • 考虑到上面第5点里提到的hu8E5–2I-28Z产生细胞因子的能力最强，还有种种体外体内的数据支持其有着更好的抗肿瘤活性的趋势，因此hu8E5–2I-28Z T细胞在下面被用于PDX模型中抗肿瘤的研究。

  • 在胃癌的PDX模型GA0006中，肿瘤移植后的第15日，小鼠分别静脉注射hu8E5–2I-28Z T和UTD（每组n=7），在第47日hu8E5–2I-28Z组相比UTD组，肿瘤大小(hu8E5–2I-28Z组 vs UTD组：252.6(158.6) mm^3 vs 1029.1(852.7) mm^3，P < .001)和重量(P=.007)都有明显的下降。

  • 而在胃癌的PDX模型GA0060中（每组n=6），在第53日hu8E5–2I-28Z组相比UTD组，肿瘤大小也是显著缩小，hu8E5–21-28Z组 vs UTD组：22.0 (53.8) mm^3 vs 498.8(118.1) mm^3, P < .001。

  • 这些结果表明：CLDN18.2 CAR-T细胞可以有效的消除体内移植的CLDN18.2阳性的胃癌组织。

7 CAR-T细胞在体内的持久性与渗透能力

  • 随后分析了移植了肿瘤组织的小鼠中，CAR-T在血液中的持久性在肿瘤组织的渗透能力。流式细胞分析了3个小鼠PDX模型在输注T细胞后的第14天的外周血，CLDN18.2 CAR-T细胞组相比UTD组，CD4+ 和CD8+ T细胞数都有显著的增加(P<.001)，其中以CD8+ T细胞（即细胞毒T淋巴细胞）为主。说明在体内的持续性的确很好。

  • 通过CD3ζ的免疫染色确认随后CAR-T细胞的渗透，发现CAR-T细胞很好的浸润到CLDN18.2阳性的肿瘤附近，而UTD组的肿瘤周围并没有T细胞。

  • 综上所述，CLDN18.2 特异的CAR-T细胞可以在体内持续存留，并且运输、浸润到CLDN18.2阳性的肿瘤组织。

8 小鼠模型中的靶点毒性(on-target off-tumor  toxicities)

  • 由于hu8E5-2I对小鼠的CLDN18.2也有很高的亲和力，因此需要排除CAR-T细胞对小鼠的胃组织也有毒性。

  • 首先检测了CAR-T细胞对表达了mouse CLDN18.2的293T细胞的毒性，发现hu8E5-2I T细胞可以强力裂解表达了mCLDN18.2 的293T细胞：当CAR-T:293T即E:T比例1:3、1:1和3:1时，裂解比例70.8%、92.0%和118.1%，各个比例差异显著：hu8E5-2I vs mock p< .001。同时mock T细胞却不能裂解CLDN18.2阳性的细胞。

  • 随后检测发现小鼠胃组织中mCLDN18.2也是高表达，和人的胃组织中hCLDN18.2的高表达具有可比性。

  • 令人惊喜的是，在用hu8E5-2I T细胞处理后，小鼠的胃组织和其它器官都没有观察到明显的损伤。

  • 而同时，小鼠胃癌PDX模型输注了CAR-T细胞和UTD处理的相比，体重也有没下降。

  • 以上说明，hu8E5-2I T细胞在小鼠体内不会损伤表达mCLDN18.2的组织，没有靶点毒性。

讨论并展望

近来nivolumab在霓虹获批治疗胃癌，使得免疫疗法治疗胃癌充满希望。但是nivo也只是将OS提升了1个月，说明免疫治疗尽管可行，但是还是需要更有效的策略。作为目前最令人鼓舞的免疫治疗方法，CAR-T细胞治疗正在通过靶向EpCAM、HER2和MUC1来研究胃癌的治疗，但是目前还没有临床结果。

由于CLDN18.2的表达严格的限定在胃黏膜分化细胞，这可能是适合CAR-T治疗的潜在靶点。和其他研究类似，本文发现CLDN18.2在正常胃组织的表达和在原发性胃癌组织及转移病灶中的高表达。有趣的是，原发性胃癌组织和转移病灶中的高表达接近，表明CLDN18.2的表达水平在病灶转移时没有明显的的改变。

本研究开发了特异性靶向CLDN18.2而非CLDN18.1的人源化单抗hu8E5，并在此基础上得到优化版的hu8E5-2I，这个单抗同时也能靶向猕猴和小鼠的CLDN18.2，这对评估毒性很重要。

在利用hu8E5及hu8E5-2I的scFv构建的一系列靶向CLDN18.2的CAR T细胞都能以特异性的摧毁表达对应抗原的胃癌细胞，而hu8E5-28z T细胞好于hu8E5-BBz T细胞。另外hu8E5-2I-28z T细胞在体外的细胞毒左右和hu8E5-28z T细胞相近。还有一个有趣的地方，hu8E5-2I-28z T细胞处理后产生的细胞因子显著高于其它CAR-T。

随后体内实验的一系列结果也提示hu8E5-2I-28z的抗肿瘤活性高于hu8E5-28z。原因可能有两个：更高的亲和力和更高的单体比例。但是在小鼠PDX模型中这两种CAR-T细胞比较接近，需要进一步的研究来理解两者的差异。研究还发现CAR-T细胞可以有效的渗透到肿瘤组织，这在一定程度上模拟了肿瘤微环境。

靶点毒性是CAR-T治疗特有的问题，先前报道过1名乳腺癌患者接受HER2 CAR-T治疗后死亡，原因是其肺部也表达这个靶点。本研究也检测到鼠胃组织中mCLDN18.2的表达，虽然hu8E5-2I结合mCLDN18.2亲和力很高并能裂解表达mCLDN18.2的2931细胞，但是hu8E5-21-28z T细胞对小鼠胃组织却没有明显的伤害，对于这种异常有两种假说：1）正常小鼠尾部组织的结构能够组织hu8E5-2I结合暴露的mCLDN18.2的抗原表位；2）小鼠胃组织的微环境抑制了CAR-T细胞的毒作用。

本项研究也有几个不足：1）没有用原位的胃癌模型研究CAR-T的抗肿瘤活性，因此不知道靶点毒性在原位是否更明显；2）CAR-T细胞在人体内的抗肿瘤的免疫功能是不是会不同，毕竟产生的细胞因子在小鼠体内只是部分有活性。

总结如下：有着清除肿瘤细胞的能力和良好的安全谱，靶向CLDN18.2 的CAR-T治疗有希望成为CLDN18.2阳性的胃癌和其它实体瘤的有效疗法。

第三部分  IMAB362 简介——靶向CLDN18.2的单抗的数据

IMAB362是特异性靶向CLND18.2的单抗，最早德国Ganymed开发，后Ganymed被安斯泰来收购。

2016年ASCO会议披露了EOX（表柔比星、奥沙利铂和卡培他滨）联合 IMAB362对比EOX治疗一线进展的胃癌以及胃食管交界腺癌(GEJ) 的2期数据。研究共入组患者 730 例，结果显示 352 名（48%）CLDN18.2阳性。与 EOX 方案相比，IMAB362 联合 EOX 可提高无进展生存期和总生存期。

目前一线治疗CLDN18.2阳性HER2阴性的局部进展或转移型胃癌或胃食管交界腺癌的3期临床正在进行中，这也是收购后IMB362开展的最关键的临床。

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