【LorMe周刊】番茄根际厚壁菌门和放线菌门丰度的失衡导了青枯病的发生
作者：伍茜雅，南京农业大学硕士在读。主要研究番茄青枯病生物阻控技术。
根际有益菌的丰富度有利于抑制土传病害，但有益菌的失衡是否会影响病害的发生，目前还不清楚。本文分析了韩国三个不同地点的温室中种植的健康和发病番茄的根际微生物群落。发病番茄根际土(DRS)中革兰氏阳性放线菌门和厚壁菌门的丰度低于健康根际土(HRS)，而青枯菌的丰度却没有显著差异。为了验证放线菌门和厚壁菌门的作用，作者添加万古霉素进行人工干扰，抑制HRS中的革兰氏阳性菌，发现可增加番茄青枯病的发生。为了进一步验证菌株的功能，作者从HRS筛选出4个潜在有益菌株。室内培养表明，这4个菌株对青枯菌没有拮抗作用，但能激发植物的免疫响应，由这4个株菌组成的合成菌群对青枯菌表现出较强的免疫性。总体而言，作者的结果首次表明，DRS中有益的革兰氏阳性细菌群落的失衡促进了土传病害的发生。
作者发现一般青枯病在田间或温室的发病症状只随机出现在局部地区（斑块化现象），在两株相距小于30厘米的健康植株之间出现了一棵受青枯病影响的死亡或垂死的番茄植株。为了探究健康和发病番茄根际微生物群落的差异，作者从两种土壤悬液中浸提出根际微生物群落，并将菌悬液接种至种有番茄苗的无菌土壤中。为了检验从HRS（健康根际土）和DRS（发病根际土）样品中提取的微生物组分是否与青枯病的发生有关，作者用MES缓冲液处理番茄作阴性对照，BTH处理（苯并噻二唑）作阳性对照。结果表明，在HRS和DRS中青枯病菌的种群数量差异并不显著，但发病率有显著差异。这表明，番茄青枯病发生的差异是由于HRS和DRS之间土壤微生物组成的差异造成的，而不是青枯菌的丰度。
图1 基于16S rRNA扩增子测序的HRS和DRS土壤微生物群落比
为了检测健康根际和发病根际微生物群落组成的差异，作者对从三个地区采集的HRS和DRS样品进行了16S rDNA扩增序列测定。根际微生物相对丰度分析表明，变形杆菌门、厚壁菌门、放线杆菌门、酸杆菌门和拟杆菌门是主要的细菌群落（图1a）。α多样性分析显示根际细菌的均匀度和丰富度没有差异，而基于Bray–Curtis差异指数的主坐标分析显示了HRS和DRS样品之间差异明显（图1b）。在5个主要的门中，HRS样品中革兰氏阳性厚壁菌门和放线杆菌门的丰度高于DRS；另一方面，潭阳和光州2个地点的HRS样本中变形杆菌门和拟杆菌门的丰度低于DRS，但在龙仁地区较高。相反，在龙仁地区的HRS样品中，酸杆菌门的丰度低于DRS样品，但在潭阳和光州地区较高（图1c）。
为了验证厚壁菌门和放线菌门在HRS组分中的富集程度，作者进行了3%KOH柱试验，并在含有20μg/mL多粘菌素B或5μg/mL万古霉素的选择性培养基上培养厚壁菌门和放线杆菌门，以计算其CFU。结果表明，与DRS样品相比，HRS样品中的厚壁菌门和放线菌门与革兰氏阴性菌的比率分别提高了26.2%和26.3%（图1d）。在厚壁菌ASV中，潭阳和龙仁的3个杆菌类ASV、光州的2个杆菌类ASV和1个梭状芽孢杆菌类ASV是HRS样本中最具代表性的ASV（图1e）。同时，在放线菌ASV中，龙仁的2个放线菌类ASV和1个Acidimicrobiales ASV，以及光州的3个放线菌类ASV是HRS样本中最具代表性的ASV（图1e）。以上数据表明，根际中芽孢杆菌和放线杆菌类微生物相对丰度的变化决定了抑制番茄青枯病的能力。
图2 番茄根际厚壁菌门和放线菌门的微生态失调
为了研究厚壁菌门和放线菌门在番茄青枯病发病中的作用，作者用抗革兰氏阳性菌的抗生素万古霉素对厚壁菌门和放线菌门微生物的生长进行抑制。作者发现万古霉素可以抑制厚壁菌门和放线菌门微生物在HRS中的生长（图2a）。与HRS处理相比，万古霉素预处理的HRS增加了番茄青枯病发病的严重性；相反，万古霉素预处理的DRS与对照相比，青枯病发病的严重性无明显变化。与对照组相比，外源添加万古霉素并没有影响青枯病的严重性（图2b），并且万古霉素也没有直接抑制青枯病菌的生长。在3%KOH柱试验中，HRS+万古霉素处理的番茄根际中，厚壁菌门和放线菌门的比率在接种5周后显著低于HRS处理的番茄根际，而DRS和DRS+万古霉素处理之间没有发现差异（图2d）。然而在接种5周后，HRS、HRS+万古霉素以及DRS和DRS+万古霉素处理之间，番茄青枯菌和细菌总数没有显著差异（图2c）。这些数据表明，对万古霉素敏感的HRS特异性厚壁菌门和放线菌门微生物的失衡降低了HRS对青枯菌的抑制作用。
图3 HRS和DRS样品中耐热厚壁菌门和放线杆菌门的鉴定
经实验室筛选培养，作者在筛选的326个菌落中，分别从热处理的HRS和DRS样品中分离出属于厚壁菌门和放线菌门的59和67个革兰氏阳性菌，从三个不同的HRS样品中分离出30个杆菌和1个放线菌（图3a、b）。其中菌株HRS1分离自三个地区，菌株HRS2分离于潭阳和龙仁地区，菌株HRS3和菌株HRS4分别分离自龙仁和潭阳地区（图3b）。尽管在HRS中耐热短杆菌和芽孢杆菌的相对丰度略高于DRS，但这种差异并不显著（图3c）。与对照相比，菌株HRS1和菌株HRS2在接种13、14天后显著降低了青枯病严重性，相比之下，BTH（苯并噻二唑处理）仅在接种13天后降低了土传青枯病发病的严重性，而菌株HRS3和菌株HRS4在所有的时间点都不能抑制青枯病的发生（图3d）。这些结果表明，耐热短杆菌（HRS1）和芽孢杆菌（HRS2）在抑制番茄青枯病中起着重要作用。
在共培养过程中，青枯菌与4个菌株之间无拮抗作用，因此假设这4种根际微生物是通过激发番茄中的系统抗性（ISR，诱导系统抗性）来抑制青枯病的。当这4株菌施用在番茄根部时，菌株HRS1和菌株HRS2在接种3天后降低了青枯病的严重性，相比之下，菌株HRS3和菌株HRS4未能降低病害严重性。这表明菌株HRS1和菌株HRS2能够激发番茄产生ISR。此外，在接种3天后，HRS部分（同时具有厚壁菌门和放线菌门）激活的ISR比菌株HRS1或菌株HRS2激活的ISR大两倍，并一直维持到接种5天后。与对照组相比，HRS组分在接种2、3、5天后显著降低青枯病严重性，而DRS组分除了在接种2天后外，未能抑制青枯病的发生。这些结果引发了作者的假设，厚壁菌门和放线菌门在HRS中引起了一种组合效应。
图4 由四种HRS特异性硬壁菌菌株（HRS1-4）组成的合成群落激活ISR
作者通过构建合成群落检测其对番茄青枯病的抑制作用。与对照组相比，HRS1+HRS2+HR4菌群和4个菌株的菌群都可降低青枯病严重性（图4a），由4个菌群组成的合成群落可以更好的降低青枯病的严重性。这表明，由4个菌群组成的合成群落激发了最高水平的ISR。为了研究由这4个菌株组成的合成群落是否激发了番茄的系统免疫，作者分析了参与JA、SA、ET和ABA信号传递的防御相关基因在接种后0h和12h在叶片中的表达情况。与对照组相比，在接种12天后，用合成群落处理的JA信号标记基因Pin2、AOS和LoxD表达上调。此外，合成群落在接种12天后促进了SA信号标记基因PR-P6、NPR1和PR1a的表达（图4b），但ET和ABA信号基因的表达不被激发，这表明，合成群落诱导了依赖JA-和SA-的番茄ISR。
论文信息
原名：Disruption of Firmicutes and Actinobacteria abundance in tomato rhizosphere causes the incidence of bacterial wilt disease
译名：番茄根际厚壁菌门和放线菌门丰度的失衡导致了青枯病的发生
期刊：The ISME Journal
IF2019：9.180
发表时间：2020.03
通讯作者：Choong-Min Ryu
通讯作者单位：克里布传染病研究中心分子植物细菌学实验室