limma/voom，edgeR，DESeq2分析注意事项，差异分析表达矩阵与分组信息 / 开普饭

我们阅读量破万的综述：RNA-seq这十年（3万字长文综述）

给粉丝朋友们带来了很多理解上的挑战，所以我们开辟专栏慢慢介绍其中的一些概念性的问题，上一期：

箱线图的生物学含义

这一讲我们来说一下limma/voom，edgeR，DESeq2，转录组差异分析的三大R包!

差异分析的第一步是要构建符合不同模型的R对象，主要包括两部分的信息：表达矩阵和分组信息。
这次主要讨论一下limma/voom，edgeR，DESeq2是转录组差异分析的三大R包的表达矩阵和分组矩阵构建，主要针对二分组转录组数据的差异分析。

一、limma和edgeR包的表达矩阵和分组信息

1.limma和edgeR包DEGList对象的构建

limma和edgeR包都是由一个研究团队开发，方法之间互相继承。edgeR是专门针对转录组数据开发的，limma包最早是用来进行芯片数据的差异分析，对转录组数据差异分析的功能是后来添加的，表达矩阵的构建方法直接使用edgeR包中的DGEList函数。

DEGList函数的参数示例：

DGEList(counts = matrix(0, 0, 0), lib.size = colSums(counts), norm.factors = rep(1,ncol(counts)), samples = NULL, group = NULL, genes = NULL, remove.zeros = FALSE)

使用airway中的转录组表达矩阵来演示

# BiocManager::install(c("airway", "edgeR")) > library(airway) > data(airway) # 获取基因counts矩阵 > exprSet <- assay(airway) > exprSet[1:6,1:6] SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047 ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0 ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799 ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331 ENSG00000000460 60 55 40 35 78 63 ENSG00000000938 0 0 2 0 1 0 exprSet <- assay(airway) # 获取分组信息 > group_list <- colData(airway)$dex > group_list [1] untrt trt untrt trt untrt trt untrt trt Levels: trt untrt

使用 DEGList函数构建limma和edgeR包需要的输入矩阵：

> dge <- edgeR::DGEList(counts=exprSet) > dge An object of class "DGEList" $counts SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520 ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047 770 ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0 0 ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799 417 ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331 233 ENSG00000000460 60 55 40 35 78 63 76 SRR1039521 ENSG00000000003 572 ENSG00000000005 0 ENSG00000000419 508 ENSG00000000457 229 ENSG00000000460 60 64097 more rows ...

$samples group lib.size norm.factors SRR1039508 1 20637971 1 SRR1039509 1 18809481 1 SRR1039512 1 25348649 1 SRR1039513 1 15163415 1 SRR1039516 1 24448408 1 SRR1039517 1 30818215 1 SRR1039520 1 19126151 1 SRR1039521 1 21164133 1

可以看到包含了counts矩阵和一些其他用于差异分析要使用的信息，还可以把分组信息添加进来。

> DEG <- edgeR::DGEList(counts=exprSet,group=factor(group_list)) > DEG An object of class "DGEList" $counts SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520 ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047 770 ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0 0 ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799 417 ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331 233 ENSG00000000460 60 55 40 35 78 63 76 SRR1039521 ENSG00000000003 572 ENSG00000000005 0 ENSG00000000419 508 ENSG00000000457 229 ENSG00000000460 60 64097 more rows ...

$samples group lib.size norm.factors SRR1039508 untrt 20637971 1 SRR1039509 trt 18809481 1 SRR1039512 untrt 25348649 1 SRR1039513 trt 15163415 1 SRR1039516 untrt 24448408 1 SRR1039517 trt 30818215 1 SRR1039520 untrt 19126151 1 SRR1039521 trt 21164133 1

这些使用方法适用于绝大多数limma和edgeR包差异分析的表达矩阵构建。

2.limma和edgeR包分组矩阵的设置

limma和edgeR的假设都是数据符合正态分布，构建线性模型。
使用model.matrix函数构建分组信息的矩阵，就是将分组信息二值化，用0和1构成的矩阵来代表不同的分组信息。

> design <- model.matrix(~0+factor(group_list)) > colnames(design) <- levels(factor(group_list)) > rownames(design) <- colnames(exprSet) > design trt untrt SRR1039508 0 1 SRR1039509 1 0 SRR1039512 0 1 SRR1039513 1 0 SRR1039516 0 1 SRR1039517 1 0 SRR1039520 0 1 SRR1039521 1 0 attr(,"assign") [1] 1 1 attr(,"contrasts") attr(,"contrasts")$`factor(group_list)` [1] "contr.treatment"

需要注意的一点是下面两种构建模型矩阵的区别

> design <- model.matrix(~factor(group_list)) > design (Intercept) factor(group_list)untrt 1 1 1 2 1 0 3 1 1 4 1 0 5 1 1 6 1 0 7 1 1 8 1 0 attr(,"assign") [1] 0 1 attr(,"contrasts") attr(,"contrasts")$`factor(group_list)` [1] "contr.treatment"

> design <- model.matrix(~0+factor(group_list)) > design factor(group_list)trt factor(group_list)untrt 1 0 1 2 1 0 3 0 1 4 1 0 5 0 1 6 1 0 7 0 1 8 1 0 attr(,"assign") [1] 1 1 attr(,"contrasts") attr(,"contrasts")$`factor(group_list)` [1] "contr.treatment"

第一种方法是将第一列的分组信息作为线性模型的截距，第二列开始依次与第一列比较，通过coef参数可以把差异分析结果依次提取出来。

第二种方法，仅仅是分组信息而已，需要通过makeContrasts函数来制作差异比较矩阵控制。

> # 通过makeContrasts设置需要进行对比的分组 > comp='trt-untrt' > cont.matrix <- makeContrasts(contrasts=c(comp),levels = design) > cont.matrix Contrasts Levels trt-untrt trt 1 untrt -1

二、DESeq2包的表达矩阵和分组信息的构建

1.DESeq2包输入文件：DESeqDataSet对象的制作

构建DESeqDataSet函数的参数示例：

DESeqDataSet(se, design, ignoreRank = FALSE)


DESeqDataSetFromMatrix(countData, colData, design, tidy = FALSE,

  ignoreRank = FALSE, ...)
DESeqDataSetFromHTSeqCount(sampleTable, directory = ".", design,

  ignoreRank = FALSE, ...)

DESeqDataSetFromTximport(txi, colData, design, ...)

DESeqDataSet使用示例：从SummarizedExperiment流程中产生的数据导入

> library(airway) > data(airway) > ddsSE <- DESeq2::DESeqDataSet(airway, design = ~ cell + dex) > ddsSE class: DESeqDataSet dim: 64102 8 metadata(2): '' version assays(1): counts rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99 rowData names(0): colnames(8): SRR1039508 SRR1039509 ... SRR1039520 SRR1039521 colData names(9): SampleName cell ... Sample BioSample >

DESeqDataSetFromMatrix使用示例：从count矩阵中构建DESeqDataSet：

> colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet),group_list=group_list) > dds <- DESeq2::DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,colData = colData, design = ~ group_list) > dds class: DESeqDataSet dim: 64102 8 metadata(1): version assays(1): counts rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99 rowData names(0): colnames(8): SRR1039508 SRR1039509 ... SRR1039520 SRR1039521 colData names(1): group_list

DESeqDataSetFromHTSeqCount使用示例：从HTSeqCount中导入数据

# 指定表达矩阵文件所在的文件夹 > directory <- system.file("extdata", package="pasilla", + mustWork=TRUE) > > directory [1] "/Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.6/Resources/library/pasilla/extdata" > sampleFiles <- grep("treated",list.files(directory),value=TRUE) > sampleFiles [1] "treated1fb.txt" "treated2fb.txt" "treated3fb.txt" "untreated1fb.txt" [5] "untreated2fb.txt" "untreated3fb.txt" "untreated4fb.txt" > sampleCondition <- sub("(.*treated).*","\\1",sampleFiles) > sampleCondition [1] "treated" "treated" "treated" "untreated" "untreated" "untreated" "untreated" # 构建包含表达矩阵文件信息的数据框 > sampleTable <- data.frame(sampleName = sampleFiles, + fileName = sampleFiles, + condition = sampleCondition) # 导入为DESeqDataSet对象 > ddsHTSeq <- DESeq2::DESeqDataSetFromHTSeqCount(sampleTable = sampleTable, + directory = directory, + design= ~ condition) > ddsHTSeq class: DESeqDataSet dim: 70463 7 metadata(1): version assays(1): counts rownames(70463): FBgn0000003:001 FBgn0000008:001 ... FBgn0261575:001 FBgn0261575:002 rowData names(0): colnames(7): treated1fb.txt treated2fb.txt ... untreated3fb.txt untreated4fb.txt colData names(1): condition

DESeqDataSetFromTximport使用示例：通过Tximport导入不基于比对的基因定量矩阵，主要是以下四个常用软件

Salmon (Patro et al. 2017)
Sailfish (Patro, Mount, and Kingsford 2014)
kallisto (Bray et al. 2016)
RSEM (Li and Dewey 2011)

# 加载R包及示例数据 > library("tximport") > library("readr") > library("tximportData") > dir <- system.file("extdata", package="tximportData") # 设置分组信息 > group_list <- factor(rep(c("A","B"),each=3)) # 获取表达矩阵所在的文件夹，salmon的结果为例 files <- list.files(file.path(dir,"salmon"),pattern = "*quant.sf.gz", recursive = TRUE) full_files_path <- file.path(dir,"salmon",files) # 读入转录本和基因对应列表 > tx2gene <- read_csv(file.path(dir, "tx2gene.gencode.v27.csv")) Parsed with column specification: cols( TXNAME = col_character(), GENEID = col_character() ) > head(tx2gene) # A tibble: 6 x 2 TXNAME GENEID <chr> <chr> 1 ENST00000456328.2 ENSG00000223972.5 2 ENST00000450305.2 ENSG00000223972.5 3 ENST00000473358.1 ENSG00000243485.5 4 ENST00000469289.1 ENSG00000243485.5 5 ENST00000607096.1 ENSG00000284332.1 6 ENST00000606857.1 ENSG00000268020.3 # txi倒入需要两个参数：表达矩阵所在路径和基因转录本对应的列表 > txi <- tximport(full_files_path, type="salmon", tx2gene=tx2gene) reading in files with read_tsv 1 2 3 4 5 6 summarizing abundance summarizing counts summarizing length > sampleName<- c("ERR188021", "ERR188088", "ERR188288","ERR188297", "ERR188329", "ERR188356") > colData <- cbind(sampleName, group_list) > ddsTxi <- DESeq2::DESeqDataSetFromTximport(txi, + colData = colData, + design = ~ group_list) using counts and average transcript lengths from tximport > ddsTxi class: DESeqDataSet dim: 58288 6 metadata(1): version assays(2): counts avgTxLength rownames(58288): ENSG00000000003.14 ENSG00000000005.5 ... ENSG00000284747.1 ENSG00000284748.1 rowData names(0): colnames: NULL colData names(2): sampleName group_list

2.DESeq2分组信息的设置

DESeq2的差异分析的分组信息设置比较简单，主要通过resuls函数实现

results(object, contrast, name, lfcThreshold = 0, altHypothesis = c("greaterAbs", "lessAbs", "greater", "less"), listValues = c(1, -1), cooksCutoff, independentFiltering = TRUE, alpha = 0.1, filter, theta, pAdjustMethod = "BH", filterFun, format = c("DataFrame", "GRanges", "GRangesList"), test, addMLE = FALSE, tidy = FALSE, parallel = FALSE, BPPARAM = bpparam(), minmu = 0.5)


resultsNames(object)

removeResults(object)

使用示例：

results(dds, contrast=c("condition","C","B"))

dds代表DESeq2得到了差异分析的结果，contrast的输入一个长度为3的向量，与上面构建DESeqDataSet时输入的分组信息对应。

# 如输入的分组信息是如下的因子向量 > group_list [1] A A A B B B Levels: A B # 提取A和B差异分析结果的示例如下，A代表对照组，B代表处理组，注意先后顺序，与edgeR正好相反 results(dds, contrast=c("group_list","B","A"))

三、总结

limma，edgeR，DESeq2三大包基本是做转录组差异分析的金标准，大多数转录组的文章都是用这三个R包进行差异分析。
edgeR差异分析速度快，得到的基因数目比较多，假阳性高（实际不差异结果差异）。
DESeq2差异分析速度慢，得到的基因数目比较少，假阴性高（实际差异结果不差异）。
需要注意的是制作分组信息的因子向量是，因子水平的前后顺序，在R的很多模型中，默认将因子向量的第一个水平看作对照组。

四、假如是多个分组呢

比如，大家都知道，TCGA的乳腺癌可以分成PAM50的5类，那么差异分析就复杂了，大家可以拿我3年前的WGCNA的教程做例子，下面是分组信息啦

这个时候有两个策略来做差异分析，当然，分组比较多的时候，差异分析并不是最好的策略啦，WGCNA等其它算法更好！

策略1：在分组信息里面挑选

参考我GitHub代码， https://github.com/jmzeng1314/my-R/tree/master/10-RNA-seq-3-groups

group_list cont.matrix=makeContrasts(contrasts=c('treat_12-control','treat_2-control'),levels = design) fit2=contrasts.fit(fit,cont.matrix) fit2=eBayes(fit2)


tempOutput = topTable(fit2, coef='treat_12-control', n=Inf)

DEG_treat_12_limma_voom = na.omit(tempOutput)

write.csv(DEG_treat_12_limma_voom,"DEG_treat_12_limma_voom.csv",quote = F)

tempOutput = topTable(fit2, coef='treat_2-control', n=Inf) DEG_treat_2_limma_voom = na.omit(tempOutput) write.csv(DEG_treat_2_limma_voom,"DEG_treat_2_limma_voom.csv",quote = F)

在提取差异分析结果的时候，需要指定是哪个组和哪个组在进行比较。

值得一提的是，我的GitHub简直就是宝藏，我上面提到的3年前的WGCNA的教程做例子，最近看到有两个文章就拿同样的数据代码和图片发了一个4分，一个5分的文章！！！

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31382519
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6639467/

你懂得！

策略2：提取子矩阵和子分组信息

这个很容易理解了，把表达矩阵根据自己想要进行的两两比对来筛选即可，这样就可以多次做差异分析啦，而且保证每次都只有两个分组。

参考资料

http://www.bio-info-trainee.com/1514.html
http://www.bio-info-trainee.com/255.html
http://www.bio-info-trainee.com/1533.html
https://ucdavis-bioinformatics-training.github.io/2018-June-RNA-Seq-Workshop/thursday/DE.html
http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html
http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html
https://rdrr.io/bioc/DESeq2/man/DESeqDataSet.html
https://rdrr.io/bioc/DESeq2/man/results.html
https://rdrr.io/bioc/limma/man/11RNAseq.html

limma/voom，edgeR，DESeq2分析注意事项，差异分析表达矩阵与分组信息