腺病毒的包装系统是什么?
腺病毒包装系统按照重组方式主要分为两种,一种在细菌(BJ5183)中重组,为AdEasyTM腺病毒重组系统,另外一种在QBI-293A细胞中重组,为AdMax腺病毒重组系统。
一、 AdEasyTM腺病毒重组系统
AdEasyTM腺病毒重组系统1998年由He Tong Chuan等改造的一种非常简单易用的双质粒系统,腺病毒基因组质粒pAdEasy-1和转移质粒pShuttle-CMV,pAdEasy-1质粒是Ad5腺病毒基因组,其中删除了E1基因(1-3533bp)和E3基因(28130-30830bp),
E1基因的功能区在293A细胞中得到补充;pShuttle-CMV质粒包含目的基因插入位点、Ad5基因组左右同源臂、Ad5末端重复序列(ITR)、包装信号序列、PacI双酶切位点和卡那霉素抗性。
第一步:将目的基因cDNA插入转移质粒pShuttle-CMV;
第二步:将得到的质粒用PmeI或ECORI内切酶线性化;
第三步:pShuttle-CMV和pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183,双质粒在BJ5183中发生重组,卡那霉素筛选重组子,并酶切鉴定。因为BJ5183有recA重组酶活性但同时又缺失介导细菌本身基因组重组的酶,可以用于质粒重组和转化,得到候选重组子;
第四步:将酶切鉴定正确的重组子转化DH5a感受态,在DH5a中扩大培养,质粒提取,鉴定,PacI酶切线性化,暴露其反向末端重复序列(ITR)。
第五步:线性化质粒回收后转染293A细胞,产生重组病毒颗粒,收毒,后续纯化浓缩。
另外,也可以采用单质粒两步法重组,即将AdEasy转入感受态细胞BJ5183中,再将pADEasy-BJ5183制备成感受态细胞,将构建好的穿梭质粒pShuttle-CMV用PmeI线性化后直接转化pADEasy-BJ5183感受态细胞,卡那霉素筛选重组子,并酶切鉴定,线性化后转染293A细胞。