单域抗体的免疫原性
传统的脊椎动物免疫球蛋白(Igs)是两个重链和两个轻链的四聚体。每个链的可变结构域(分别为VH和VL)组装形成抗原结合位点。1993年，Hamers-Casterman等人。在骆驼科动物（骆驼、骆驼大羊驼和羊驼)的血清中发现，除了传统的四聚体抗体外，骆驼还产生了纯二聚体重链抗体（heavy chain only antibodies，HCAb），无轻链。
因此，HCAb由两个相同的重链组成，每个重链包括两个恒定的域（CH2和CH3）、一个铰链区域和一个负责抗原识别的可变VHH结构域。VHH结构域的抗原结合仅由三个CDRs介导，而不是传统抗体的六个CDRs，其两侧有四个相对较恒定的框架区域(FRs)。VHH CDR3环非常长而延伸，形成手指状伸长。
在发现骆驼动物HCAb两年后，鲨鱼和其他软骨鱼类也发现了小分子量抗体，被称为Ig新抗原受体(Ig new antigen receptors，IgNARs)。IgNARs由两个相同的重链组成，每个重链包括五个恒定域和一个可变的VNAR结构域。与其他免疫球蛋白可变域相比，VNARs没有CDR2；然而，除了CDR1和CDR3之外，连接C-D和D-E链(分别为HV2和HV4)的环参与了抗原识别。
骆驼HCAbs和鲨鱼IgNARs具有几个特征，如高稳定性和溶解性，比平均CDR3环长等。然而，由于骆驼科物种通常更容易处理和获取，在免疫后产生更强的HCAb反应，并产生与人类IGHV基因具有相对较高同源性的免疫球蛋白，VHHs作为生物药物比VNARs引起了更大优势，VNARs目前只是有少数几个在临床前阶段。
单结构域抗体(sdAbs)比全长传统抗体有一个主要好处是它们的小分子量(~15kDa)。重组全长Igs在哺乳动物细胞中的生产成本昂贵，但sdAbs很容易在细菌和酵母等生产系统中大量表达。
与传统抗体相比，它们的快速血液清除和有效的组织和肿瘤穿透使sdAbs成为特别有效的无创成像剂。如果需要长时间暴露（例如，为了治疗慢性病），可通过融合到血清白蛋白或免疫球蛋白Fc区域来促进改善sdAbs的体内半衰期。
sdAbs的另一个重要特征是它们的模块性，使sdAbs成为构建多价和多特异性治疗和诊断分子的最佳选择。
单域抗体免疫原性原因
尽管单域抗体的分子量只有传统抗体的十分之一，即使是人源化改造之后，依然会产生抗药物抗体（ADA）。可能有下面几个原因：
原因一：传统抗体的VH和VL域之间的界面，在单域抗体暴露在外面。
原因二：单域抗体的CDR1和CDR2和人类抗体构象接近，但是长的CDR3，在人类抗体并不存在。
原因三：VHHCDRs和FRs的高水平体细胞超突变，降低它们与人类IGHV3基因产物的序列同源性。
原因四：非典型二硫键。
原理上，单域抗体产生的ADA更容易发生在针对可变区的表位，阻断可变区与抗原的结合。
临床前检测方法
在人体用药之前，需要对抗体药物的免疫原性进行评价。
首先，先前存在的ADA，可以使用动物或人类志愿者的血清样本来评估。这种方法很简单，但通常需要设计和验证单个抗体的结合试验，因此对不同抗体中ADA发病率的比较不准确。
其次，生物信息学分析。可通过存在CD4+T细胞表位(TCEs)来预测抗体免疫原性，这些表位与持续的ADA生产相关。这些工具通常基于实验数据集(肽-MHCII结合分析和细胞激活实验等)，但仍然可能高估假定的免疫原性区域的数量，因此在生物信息学预测后，应该使用基于细胞的分析方法进行验证。
第三，体外免疫分析可以帮助识别任何TCEs的存在。为此目的，已经开发了各种试验和筛选平台，包括HLA肽结合试验、T细胞表位肽筛选试验和全蛋白体外T细胞激活试验。
最后，可以通过实验动物（如小鼠或非人类灵长类动物）来评估免疫原性，尽管这通常对人类免疫原性的预测能力很差。
对啮齿类动物和非人类灵长类动物的22项免疫研究的共识是，0-37%的动物产生了单域抗体ADA，但一般没有中和作用，不影响PK/PD或安全数据。
临床研究中VHH的免疫原性
VHHs临床发展的先驱之一是Ablynx，一家比利时生物制药公司，于2018年被赛诺菲收购。收购时，Ablynx至少有8个基于VHH的临床项目，还有许多其他项目在临床前晚期或临床早期开发阶段。
大部分的临床项目都是基于人源化VHH。但是一项对羊驼抗表皮生长因子受体(EGFR)VHH的研究发现，非晶形聚合物在小鼠中具有免疫原性，而可溶性VHH和热诱导聚合物，即使在六倍剂量后依旧没有免疫原性，说明序列人源化并不是sdAb免疫原性的唯一决定因素。
截至2020年，至少有35个VHH生物药物进行临床试验，涉及1000多名患者和健康志愿者。大多数试验显示没有或只有最小的免疫原性，与完全人源或人源化的IgG相比，在0-30%的受试者中观察到短暂治疗出现的ADA，中和ADA的发生小于3%。
与大多数VHHs观察到的最小免疫原性相比，针对死亡受体5(DR5)的四倍人源化VHH(TAS266)一期安全性和耐受性研究中出现意外的肝毒性。在临床前研究中，TAS266作为DR5激动剂，比传统的抗DR5抗体具有更好的抗肿瘤疗效。服用3mg/Kg TAS266的患者中有3例因研究药物产生≥3级肝毒性，试验提前终止。在三名出现肝毒性的患者中检测到先前存在的ADA，但没有有出现肝毒性的患者中均未检测到这种ADA。作者认为，先前存在的ADAs可能会促进免疫复合物形成，这些免疫复合物可能在肝脏中积累，结合DR5，并通过激活补体和炎症诱导细胞凋亡。TAS266的情况需要更详细的研究显示，毒性机制可能不依赖于先前存在的ADAs，而是因为四倍体抗体的超高效力。
小编总结
单域抗体分子量小，可以使用原核表达，其实体瘤穿透性可能比传统抗体更好，生产成本更低。虽然分子量小，但是其结构与传统抗体差异较大，即使在全人源的情况下，也可能会产生抗药物抗体。但是目前从临床试验的数据来看，其ADA的产生确实较少，且一般没有中和活性。个别的临床研究出现了肝毒性及CRS等，可能因为体内预先存在了ADA，或者效力过强。
参考文献