科研| FOOD CHEM：HPLC-MS法测定常见蔬菜的酚酸谱（国人佳作）
编译：谢勇飞，编辑：谢衣、江舜尧。
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酚酸是一种在日常食物摄取中广泛分布的植物化学物质，酚酸参与了多种生理活动，例如养分吸收，酶活性，蛋白质合成，光合作用，种子、叶、根和茎的细胞骨架结构，植物酚酸主要通过莽草酸途径产生，植物中发现的酚酸的两个主要类别是C6-C1和C6-C3。C6-C1酚酸具有羟基苯甲酸骨架，包括原儿茶酸、没食子酸、香兰素酸、龙胆酸和丁香酸。C6–C3酚酸具有羟基肉桂酸骨架，包括咖啡酸、芥子酸、对香豆酸，邻香豆酸、阿魏酸和异芥酸。自然界中发现的大多数生物活性酚类化合物是复杂的酚酸衍生物，植物中的酚酸以游离、游离的酯以及共轭（结合）形式呈现。由于酚酸具有抗氧化特性致使酚酸具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎和血管舒张活性等生物学活性。酚酸是一种次生代谢产物，通常在植物源性食物中可以找到，是我们日常饮食的重要组成部分。蔬菜、水果作为天然食品，营养丰富，对人体健康具有重要意义。矿物质、维生素、抗氧化剂和色素普遍存在于蔬菜中。蔬菜如菠菜、西兰花和洋葱富含抗氧化剂，十字花科蔬菜也是天然抗氧化剂的丰富来源，十字花科蔬菜中酚类、生育酚和抗坏血酸含量较高，其中对活性氧损伤具有保护作用。在日本进行的一项研究调查了8种叶菜类蔬菜的酚酸组成和抗氧化能力。然而，中国研究人员很少对传统蔬菜的酚酸组成进行深入研究。因此，本研究的结果可以增进我们对蔬菜酚酸谱的了解，并对食品营养学家和消费者有益。本文使用HPLC-MS对我国常见的44种蔬菜中的这些酚酸进行了定性和定量分析，并对游离可溶性酚酸和结合不溶性酚酸的分布和浓度进行了测定，测定结果可作为植物食物营养数据库的补充。
论文ID
原名：Determination of phenolic acid profiles by HPLC-MS in vegetables commonly consumed in China
译名：HPLC-MS法测定常见蔬菜的酚酸谱
期刊：FOOD CHEMISTRY
IF：5.399
发表时间：2018年10月13日
通讯作者：陆柏益,刘贤金
通讯作者单位：浙江大学生物系统工程与食品科学学院，江苏省农业科学院食品质量安全与营养研究所
实验设计
本文首先通过蔬菜采集地，蔬菜的消费频率，不同地区，季节蔬菜的生产情况等因素，确定了44种蔬菜，蔬菜样品随机从杭州、重庆、广州、北京、武汉5个城市的大型现代超市和传统开放市场购买，每种蔬菜至少采集15个样本，收集了660多份样品，并将其分为六类：水果、叶、根、花、茎和豆类，采集的同一蔬菜样品（仅包括可食用部分）均化为混合样品。冷冻干燥后，44个混合样品在-80°C下储存，分析时，首先使用GB/T 134 5009.3-2010标准对样品含水量进行检测，游离酚酸样品制备：从含有0.2%维生素C的20毫升80%甲醇水溶液中提取样品2 g样品，在涡流振荡10秒后，在室温下对样品进行30分钟的超声波处理，高速离心，将上清液移入50ml容量瓶中，在重复提取之后，混合上清液。分析之前将上清加水至50 mL并通过0.22μm微孔膜。游离酚酸酯样品的制备：提取过程同游离酚酸样品制备至高速离心取上清液，之后将上清液移到100毫升梨形烧瓶中。重复提取后，组合上清液减压浓缩浓缩至至20毫升，将浓缩液移入150 mL锥形瓶中，并用20 mL 4 M氢氧化钠水溶液处理，并且氮吹，将混合溶液在40℃下在气浴中水解2 h，摇动并避光。通过添加4 M盐酸水溶液，将pH值调整为2。将混合液与20毫升正己烷在室温下摇动20分钟，然后去除正己烷层。接着40mL乙酸乙酯提取水层，用旋转蒸发器在35℃下将混合提取物浓缩至几乎干燥，残渣溶解在10毫升50%甲醇/水中，通过0.22μm微孔膜。结合酚酸分析用样品的制备：同游离酚酸酯样品的制备。HPLC–MS 分析：用安捷伦1260系列高效液相色谱仪对酚酸提取物进行了分析，在反向C18柱上进行分离，温度保持45℃，A相乙腈，B相0.1%水甲酸溶液，以0.25毫升/分钟的流速泵送，总运行时间为20分钟，注射量为5μL。浓度梯度如下，0%–5% A持续1分钟，5%–13%A持续1分钟，13%–184 15%A持续4分钟，15%–21%A持续1.5分钟，21%A持续1分钟，21%–27%A持续1分钟，27%–50%A持续2.5分钟，50%A持续1分钟，50%–5%A持续1分钟，5%A持续6分钟。使用ESI的质谱（QTRAP 6500，AB Sciex, Framingham, USA）同时进行多反应监测，并进行正负离子模式扫描，ESI条件如下：4400和-4400 V之间的离子喷射电压，温度：400°C，幕式氮气:30 psi,碰撞气体：氮气，15psi，雾化器气体：空气，60psi,和加热器气体：空气，65 psi，使用Analyst 1.5.1版软件进行数据采集和处理。统计分析：至少15种蔬菜中制备的混合样品的以三种方法对酚酸水平进行测量，采用SPSS 20.0软件进行分析。
实验结果
1.高效液相色谱-质谱法方法的优化与验证
首先对17种酚酸进行了表征，以确定其前体离子，并为MRM 选择产物离子，考虑到全扫描质谱中优势离子的灵敏度和重现性，我们选择了17种酚酸的负模式。基于分析的峰面积优化了HPLC-MS 参数以最小化基质效应并提高总灵敏度，参数包括毛细管电压、去聚集电位、碰撞能和保留时间，优化参数见表1，
蔬菜中含有17种酚酸的标准品和质谱进行了比对，通过测量六种浓度的标准溶液制备每种化合物的校准曲线，在进行HPLC-MS分析之前，通过在样品中加入极低浓度的分析物来确定分析方法的限值，计算了检测限，结果显示，校正曲线在0.005-50.0mg/L浓度范围内呈线性趋势，相关系数良好（R2>0.990）。LOD值在0.008-0.042mg/L范围内，日内和日间相对标准偏差分别低于6.4%和6.2%。现行方法的灵敏度明显高于以往报道的方法。高效液相色谱质谱法也能比以前报道的方法检测更多的蔬菜中的酚酸，将蔬菜样品（2.0g）分别加入1.0和5.0mg/L 的酚类标准品，测定回收率。提取加标样品，然后用改进的方法进行分析。每个实验在每个级别重复6次，浓度水平和详细结果见表2。回收率在71.0%-110.7%之间，RSD在2.05%-9.98%之间。
表1 44种蔬菜中17种酚酸的组成和含量
表2 蔬菜中17种酚酸的线性回归、LOD和回收率
2.44种蔬菜酚酸谱的研究
采用高效液相色谱-质谱联用法测定了我国常见的44种蔬菜中17种主要酚酸的含量和组成（图1），6大类蔬菜中17种酚酸的平均浓度顺序如下：花（64.39μg/g 鲜冻重[FW]）>根（56.68μg/g fw）>叶（53.44μg/g fw）>茎（48.07μg/g fw）>豆类（20.83μg/g fw）>水果（16.92μg/g fw），此外酚酸蔬菜中的种类分布如图2所示。叶菜（17种）、根菜（17种）、茎菜（17种）的酚酸含量均高于豆类（3-10种）、水果（12-13种）、花卉（9-10种）。结果还表明，酚酸在不同蔬菜品种中的分布变化。芸苔科、百合科、菊科、葫芦科和茄科蔬菜中检测到的酚酸有10种以上，豆科蔬菜中检测到的酚酸有4-10种。不同种类蔬菜的酚酸浓度和比例有差异，同一蔬菜不同组织中酚酸含量存在显著差异。
图1 44种蔬菜中17种酚酸的组成和浓度
对主要酚酸进行了定量分析。阿魏酸和芥子酸（44种蔬菜中检出）、没食子酸（43种蔬菜中检出）、咖啡酸（41种蔬菜中检出）和对羟基苯甲酸（40种蔬菜中检出）在蔬菜中广泛存在。仅在24种蔬菜中检测到3,5-二羟基苯甲酸、2-羟基肉桂酸和3-羟基肉桂。聚类分析表明，阿魏酸（101.99-884.68μg/g干重[DW]）、异芥酸（24.81-660.41μg/g DW）和p257香豆酸（9.27-67.41μg/g DW）的含量高于其它酚酸，并且主要存在于叶菜类蔬菜中。
咖啡酸由于其芳香环上的3,4-二羟基化作用而具有比对香豆酸更高的抗氧化活性。在目前的研究中，咖啡酸和对香豆酸在这些蔬菜中被广泛检测到。本研究发现，莴苣中咖啡酸含量最高（77.91 μg/g DW）。紫甘蓝中对香豆酸含量最高（671.41μg/g DW）。甘蔗茎中阿魏酸含量极高，为（660.41μg/g DW），比排名最低的蔬菜南瓜 (2.79 μg/g DW)约高237倍，在蔬菜样品中，绿萝卜的异芥酸（884.68μg/g DW）和紫甘蓝（609.96μg/gdw）的芥酸含量最高。结果表明，萝卜、紫甘蓝、莴苣等蔬菜可能是酚酸的良好来源。不同种类蔬菜中各种营养素和抗氧化剂的含量差异很大，导致不同蔬菜的抗氧化能力不同。同时，同一种类的不同蔬菜可能表现出不同的抗氧化活性。
3.44种蔬菜中游离酚酸和结合酚酸的分布
酚酸对蔬菜品质和人体健康的影响不仅取决于酚酸的种类和数量，而且还取决于底物中存在的形式。图2显示了44种蔬菜中的游离（游离和游离酯）和结合酚酸的分布。紫甘蓝可溶性酚酸含量最高（121.42μg/g FW），莲藕最低（0.82μg/g FW）。紫甘蓝中不溶性酚酸含量最高（31.31μg/g FW），冬瓜最低（0.01μg/g FW）。6组蔬菜中含量差异有显著性（P<0.001）。除茎类蔬菜（P<0.027）外，游离可溶性酚酸在蔬菜中占优势（P<0.1）。水果（P<0.020）、豆类（P<0.001）和叶菜类（P<0.001）中几乎所有的酚酸都是少量结合的不溶性酚酸的基础上自由溶解的结合酚酸，在细胞壁中起着重要的作用，它提供物理和化学屏障，防止病原体入侵，收敛，阻止昆虫、动物、细菌和真菌的攻击；此外，结合酚酸还具有抗氧化功能。不溶性结合酚酸在消化后能在胃肠中存活，并能到达结肠，这是由于细胞壁纤维材料的消化率较低，紫甘蓝中总酚（152.73μg/g FW）和结合酚酸（77.36307μg/g FW）含量最高，这些值高于先前报告的值。这种差异可能是由于使用的检测方法。然而，在深色蔬菜（紫甘蓝和西兰花）中发现的酚酸的浓度明显高于其他蔬菜中；因此，深色蔬菜比浅色蔬菜表现出更强的抗氧化能力。酚酸之间没有协同作用，使用含2，2'-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉）的总抗氧化能力测定试剂盒仅观察到添加作用。
图2 （a) 浓度和 (b)6种蔬菜中游离和结合酚的比较。
4. 羟基苯甲酸和羟基肉桂酸在44种蔬菜中的分布
根据侧链酚环上的碳原子数，我们可以将酚酸分为C6-C3和C6-C1化合物，它们分别来自羟基肉桂酸和羟基苯甲酸，尽管具有相同的基本骨架，酚酸类芳香环上羟基的数目和位置是不同的。不同蔬菜含有羟基肉桂酸和羟基苯甲酸（图3），羟基肉桂酸由苯丙氨酸生物合成，是植物中分布最广的酚酸。17种酚酸中，羟基肉桂酸8种，羟基苯甲酸9种，试验蔬菜中羟基肉桂酸和羟基苯甲酸的含量分别为0.66-149.87和0.35-54.31μg/g FW。除胡萝卜、豆芽和花椰菜外，大多数蔬菜中羟基肉桂酸的含量均高于羟基苯甲酸（P <0.001）。紫甘蓝中羟基肉桂酸含量最高，约为最蔬菜冬瓜的230倍。豆芽中羟基苯甲酸的含量最高，比排名最低的蔬菜雪豆高出约160倍。蔬菜中羟基肉桂酸和羟基苯甲酸的总浓度存在一定的差异。
图3。（a）浓度和（b） 6种蔬菜中羟基肉桂酸和19-羟基苯甲酸的比较
结语
本文建立了一种灵敏可靠的高效液相色谱-质谱联用技术，用于蔬菜基质中17种酚酸的快速定性和定量分析。检出限为0.008mg/L～0.042mg/L，平均回收率为71.0%～110.7%，RSD≤9.98%。该方法的灵敏度比以往报道的方法高，采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法测定了我国常见蔬菜中17种酚酸的含量。六种蔬菜中总酚酸的平均浓度顺序如下：花（64.39μg/g FW）>根（56.68μg/g FW）>叶（53.44μg/g FW）>茎（48.07μg/g FW）>豆（20.83μg/g FW）>果（16.92μg/g FW）。酚酸在叶菜类（17种）、根类（17种）、茎类（17种）蔬菜中的分布比在豆类（3-10种）、水果（12-13种）和花（9-10种）中的分布更为丰富，在芸苔科、百合科、菊科、葫芦科、茄科蔬菜中检测到10多种酚酸，而在豆科蔬菜中仅检测到4-10种酚酸。阿魏酸和芥子酸（44种蔬菜中检出）、没食子酸（43种蔬菜中检出）、咖啡酸（41种蔬菜中检出）、对羟基苯甲酸（40种蔬菜中检出）。阿魏酸（101.99-884.68dw）、异芥酸393（24.81-660.41μg/g DW）和对香豆酸（9.27-67.41μg/g DW）的含量均高于其他酚酸，主要存在于叶菜类蔬菜中。除茎类蔬菜（P<0.027）外，其余蔬菜均以游离酚酸为主（P<0.001）。水果（P<0.100）、豆类（P<0.001）和叶菜类（P<0.001）中几乎所有酚酸都是游离的。在所有的样本中羟基肉桂酸浓度为0.66-149.87μg/g，羟基苯甲酸总浓度为0.35-54.31μg/g。除胡萝卜、豆芽和花椰菜外，大多数蔬菜中羟基肉桂酸的含量比羟基苯甲酸高（P<0.001）。
花、叶和根类蔬菜富含天然抗氧化剂，酚酸浓度与蔬菜的总抗氧化能力有关。因此，蔬菜可作为预防氧化应激所致疾病的重要膳食来源。这项研究的结果有望为膳食指南和流行病学研究提供有力的支持。进一步研究这些蔬菜中酚酸的代谢和生物利用度是有必要的。