科研 | Cell Death Differ.：SAT1的化学激活纠正饮食诱导的代谢综合征
编译：璐璐，编辑：Emma、江舜尧。
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多胺代谢的药理学靶向目前因其在预防和治疗几种年龄相关疾病方面的具备的潜力而备受关注。这篇文章发现三乙烯四胺二盐酸盐(TETA)是一种铜螯合剂，可以用于长期治疗威尔逊病（Wilson Disease,又称肝豆状核变性，是罕见的常染色体隐性遗传铜代谢病）的患者，且副作用较小。因为TETA可以降低葡萄糖耐受异常程度和脂肪肝，并可以诱导自噬，所以其可以减少由高脂饮食、过量蔗糖摄入或瘦素缺乏引起的肥胖。而从机理上讲，这些作用和血浆或内脏中铜的消耗并无关系。相反，TETA的作用依赖于多胺分解代谢的激活，其次是稳定亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶-1(SAT1)，从而提高SAT的酶活性。在SAT1缺陷小鼠中，TETA对高脂饮食诱导的代谢综合征的所有积极作用都消失了。这些结果表明TETA的这种积极促进作用可能被用于预防或治疗肥胖症。
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实验设计
野生型WT（C57BL/6）、ob/ob、Atg4b−/−（C57BL/6）和Sat1−/−小鼠被安置在特定的无病原体的温控环境中，光/暗周期12小时，并接受正常食物或HFD。从7周龄开始，小鼠被随机分成几组，分别喂以（I）正常食物（II）Teta（III）3%体重/体积的饮用水（IV）HFD(20%蛋白质、36%脂质和36.7%碳水化合物)（V）HFD和Teta（VI）正常食物和加入30%蔗糖的饮用水（VII）正常食物、Teta(每日腹腔注射100mg/kg)以及加入30%蔗糖的饮用水。每个实验至少使用三个生物学重复。小鼠每周称重一次，并在处理的第五/第六周左右进行代谢组学分析。
寿命分析是将18月龄的WT小鼠随机分成两组，饲养在特定的无病原体的条件下，14/10小时的光/暗周期进行富集，一直到26个月龄。在自噬诱导实验中，小鼠腹腔注射TETA(100mg/kg)，处死前2h腹腔注射亮肽素(15mg/kg)，TETA给药8h后处死小鼠。提取组织后对这些样本进行Westernblot分析以及免疫组织化学检测。
实验结果
1. TETA的代谢效应与铜的消耗无关
在标准条件下饲养下的18月龄野生型WT小鼠，长期服用TETA(饮用水中3000ppm)，寿命(图S1a)、体重(图S1b)、以及食物和水的吸收(图S1c)都没有明显的变化。表明在这个低剂量下和非病理的情况下，TETA无法耗尽心脏、肝脏和肌肉中的重金属，包括铜(图1A)、铁(图1B)和锌(图1C)。图1D质谱检测结果表明TETA广泛分布于心脏、肝脏和肌肉这些器官。TETA主要代谢物N1-单乙酰三乙烯四胺(MAT)和N1N10-二乙酰三乙烯四胺(DAT)(图1E，f)对肝脏代谢组的影响虽然不同，但在很大程度上是一致的(图S1e 、S1f)。表S1展示了检测到的全部代谢物清单。
图1 TETA对小鼠的代谢影响
A-F，TETA给药2周后心、肝、肌肉中金属含量，TETA及其单乙酰化或双乙酰化代谢产物；G-J，小鼠肝脏内源性多胺水平（亚精胺、精胺、N1Ac-亚精胺）；K-L，TETA给药5周肝脏SAT1活性和SAT1 mRNA表达；M，WT和SAT1−/−小鼠TETA(3000ppm)治疗2周后在肝脏中的N1-乙酰亚精胺与亚精胺的比值；N，多胺量；O-R，WT和SAT1−/−小鼠给药TETA(3000ppm)2周在收集肝脏和血浆前3h腹腔注射13C-亚精胺(50 mg/kg)，13C-N1-乙酰亚精胺和13C-腐胺含量。APAO乙酰多胺氧化酶，Ctrl对照，Fc折叠变化，R.U.相对单位：SAT1亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶-1、Spd亚精胺。
2. TETA提高亚精胺/SAT1的活性
与未处理的对照相比，TETA给药不影响肝脏中亚精胺和精胺的浓度(图1g，1h)，但增加了N1-乙酰化亚精胺的浓度(图1I)，以及N1-乙酰化亚精胺与非乙酰化亚精胺的比率(图1J)。N1-亚精胺的乙酰化主要由SAT1催化，虽然SAT1mRNA的表达没有增加(图1L和S2a)，但是TETA处理提高了SAT1的酶活性(图1K)。这可能与TETA稳定SAT1蛋白有关，因为多胺及其许多结构类似物已经被证明与SAT1蛋白结合并保护其免受蛋白酶体降解。事实上，我们观察到在肝脏提取物(蛋白酶体的一种来源)中重组SAT1蛋白的酶活性随着时间而降低，而在添加TETA之后这一变化有所缓解（S2b，c），从而导致SAT1的半衰期显著增加(S2d)。在SAT1−/−小鼠中，N1-乙酰亚精胺与亚精胺的比率显著降低，而在其经过TETA治疗后升高(图1M)。13C稳定同位素标记的亚精胺经腹腔注射，转化为13C-N1-乙酰亚精胺，然后转化为腐胺(图1N)。这一酶反应，是从亚精胺到N1-乙酰亚精胺(由SAT1催化)，然后到腐胺(由乙酰多胺氧化酶（APAO）催化)。在WT小鼠中被TETA治疗后显著变化，而在SAT1−/−小鼠中则没有明显变化(图1O-r)。与SAT1活性的增加相比，经过TETA处理的WT小鼠的肝脏中的乙酰辅酶A/辅酶A的比率降低(图2A，左图)，以及3-羟丁酸水平的降低(图2B，左图)，这通常与乙酰辅酶A丰度相关。此外，通过定量免疫荧光分析结果显示，经TETA处理的WT小鼠肝脏中的N-ε赖氨酸乙酰化水平降低(与乙酰辅酶A平衡，图2C，d)。在WT小鼠中，胞质蛋白中N-ε赖氨酸去乙酰化可刺激自噬，并且电泳迁移率结果显示(图2e，f)TETA可诱导微管相关蛋白1A/1B轻链3B的自噬相关变体II(以下称为LC3)，尤其是当注射亮肽素阻止了LC3-II的溶酶体破坏时结果更为显著。
而在SAT1−/−小鼠中TETA诱导的乙酰辅酶A/辅酶A比值、3-羟基丁酸和N-ε赖氨酸乙酰化以及加上自噬能力都没有明显的变化(图2A-f)。结果表明在小鼠中，TETA诱导的蛋白去乙酰化和自噬都依赖于SAT1的激活。
图2 乙酰-辅酶A的消耗、去乙酰化和TETA诱导的自噬
A，乙酰辅酶A/辅酶A比值；B，3-羟丁酸含量；C-D，免疫荧光法测定肝蛋白Nε赖氨酸乙酰化水平；E-F，加亮肽素(15mg/kg)或不加亮肽素的情况下与自噬相关的LC3的脂化水平
3. Teta对SAT1依赖的减肥和降糖作用
图3 TETA在HFD或瘦素缺乏的情况下代谢组学分析
A-C，正常食物、HFD、30%蔗糖、ob/ob在添加TETA或者不添加的情况下的小鼠体重情况、葡糖糖和胰岛素耐受性情况；图D-E，磁共振成像HFD的小鼠接受TETA治疗12周后身体成分；F-G，内脏白色脂肪组织单个脂肪细胞；H-1，肝脏中脂滴分布；J，在TETA治疗12周时血浆中的多种激素和细胞因子的多重定量热图
图4 Teta依赖SAT1的代谢效应
A，WT、SAT1−/−或ATG4b−/−小鼠在有或无TETA(饮用水中3000ppm)的情况下进行为期至少10周的HFD处理后的体重；B-E，Sat1−/−小鼠和Atg4b−/−小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素耐受性测定；F-G，SAT1−/−小鼠磁共振成像和定量分析；Sat1−/−和Atg4b−/−中内脏白色脂肪组织(H，I)进行组学分析以及肝脏组织病理学分析(J，K)
讨论
之前人们一直认为TETA在治疗Wilson病是作为一种铜螯合剂，但本研究表明，即使长期服用TETA，也不能在非病理条件下耗尽小鼠器官中的铜和其他重金属。此外还证明了TETA在体内可激活自噬，这表明TETA可能是通过其他机制治疗Wilson病，包括自噬的诱导。
然而研究表明TETA不会增加Sat1mRNA的表达，但可能会稳定SAT1酶。不管TETA稳定/激活SAT1的确切机制如何，可以确定的是在服用TETA的小鼠中SAT1被过度激活，导致亚精胺的乙酰化增强，同时消耗乙酰辅酶A，从而导致细胞蛋白N-ε赖氨酸去乙酰化和刺激自噬。而由TETA引起的一系列反应，在SAT1−/−小鼠中都不存在，这意味着SAT1的激活可以使得乙酰辅酶A减少以及诱导自噬。由于自噬诱导剂亚精胺(一种结构上与TETA相关的SAT1底物)可以预防肥胖和糖尿病，所以这篇文章探究了TETA是否对小鼠体内的代谢有类似的有益作用。结果表明，TETA减轻了肥胖条件下的体重增加(食物摄入量不变)，并减少了与肥胖相关的并发症，如糖尿病和肝骨病。与亚精胺相比，TETA需要自噬诱导（因此在部分自噬缺陷的Atg4b−/−小鼠中没有这些作用）。但是TETA的有益作用不依赖于Atg4b，这说明自噬对于TETA的减肥作用是可有可无的。但是也不能排除在这种情况下发生不依赖Atg4b自噬的可能性。
尽管如此，TETA和亚精胺都需要SAT1来调节抗肥胖作用，这意味着在SAT1−/−小鼠中，这两种多胺物质的抗肥胖、抗糖尿病和抗脂肪变性的作用都不存在。事实上，SAT1−/−小鼠的脂肪积累更多，特别是在高脂血症上，而过表达的SAT1先前已经被证明具有减肥作用。此外，SAT1的激活已经被证明有助于将白色脂肪细胞分化为米色脂肪细胞（米色脂肪细胞可能是治疗肥胖及相关代谢紊乱的重要靶点），这说明该酶还有另一种抗肥胖作用机制。这篇文章表明TETA可以增强结肠(多胺产生的一个主要部位)中SAT1的活性，使得TETA通过调节肠道多胺含量来调节代谢过程。
根据上述发现，TETA可被认为是不属于之前已知的类别一种新型的CRM，即(I)通过抑制乙酰辅酶A的合成来消耗乙酰辅酶A的药物(Ii)抑制乙酰基转移酶的药物(Iii)激活去乙酰化酶的药物。实际上TETA将是导致SAT1活化的乙酰辅酶A过度消耗的一个因素，从而起到CRM的作用。因为临床实验表明TETA长期用于治疗Wilson病是没有任何主要毒性的，所以TETA可能会用于预防或治疗肥胖及其共病。