科研| J AM SOC NEPHROL：草酸钙肾结石患儿肠道微生物组和代谢组的紊乱
编译：东莨菪碱，编辑：谢衣、江舜尧。
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肠道微生物群落的组成和功能与早发性草酸钙肾结石的关系尚不清楚。我们对88名年龄在4-18岁的患者进行了病例对照研究，其中包括44名肾结石患者，其体内含有50%的草酸钙，以及44名年龄、性别和种族相匹配的对照者。对粪便标本进行鸟枪法宏基因组测序和非靶向代谢组学研究。与对照组相比，肾结石患者肠道菌群的多样性明显降低。31个类群在肾结石患者中相对较少。包括7个产生丁酸的类群和3个降解草酸的类群，它们的低丰度反映在编码丁酰辅酶A脱氢酶的基因丰度降低。这些细菌的相对丰度与18种粪便代谢物的水平有关，肾结石患者体内这些代谢物的水平与对照组相比有所不同。肾结石患者含量较少的降解草酸细菌类群是更大的丰度相关网络（包括迟缓埃格特菌和几种乳酸杆菌）的组成部分。微生物多样性与结石发病年龄相关，随年龄增长先降低后升高。我们发现首次患结石年龄在9至14岁的个体多样性最低，而对照组在多样性方面没有显示出与年龄相关的差异。产生丁酸盐和降解草酸盐的细菌的丢失，与代谢紊乱有关，这可能是早期草酸钙肾结石发病的上游决定因素。
论文ID
原名：Perturbations of the Gut MicrobiomeandMetabolome in Children With Calcium Oxalate Kidney Stone Disease
译名：草酸钙肾结石患儿肠道微生物组和代谢组的紊乱
期刊：Journal of the American Society ofNephrology
IF：8.547
发表时间：2020.05.07
通讯作者：Gregory E Tasian
通讯作者单位：宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院
实验设计
对88名4-18岁在费城儿童医院(CHOP)保健系统接受治疗的患者进行了一项配对病例对照研究。病例包括在过去3年内自发或通过手术切除的含100％钙（其中至少50％为草酸钙）结石的偶发性和复发性肾结石患者。对照组是相匹配的健康志愿者。参与者完成相关调查问卷。营养师使用明尼苏达大学开发的营养数据系统收集受试者的每日营养和矿物质摄入量。通过图表检查确定诊断为肾结石时患者的年龄。研究人员收集参与者粪便标本，12-24小时内送达CHOP微生物中心检测。从粪便中提取基因组DNA进行鸟枪基因组测序。使用Ticinesi等人编制的清单鉴定可降解草酸盐的生物。通过检索Bergey的古生菌和细菌分类学手册鉴定产丁酸盐的生物。多样性与研究组之间的关系采用配对t检验进行评估。为了确定肾结石患者细菌数量随第一次结石年龄的增加或减少，用线性模型检验了对数转换相对丰度与年龄的线性和二次项之间的相关性。采用主成分分析(PCA)和线性判别分析(LDA)对粪便代谢组学特征进行分析。采用配对t检验来检验代谢物水平与研究组之间的关联。利用排列试验获得的P值评估了代谢物水平和细菌种类丰度之间的相关性的显著性。
实验结果
1研究人群特征
本研究包括44例偶发或复发的≤18岁的草酸钙肾结石患者和44例健康对照者（表1）。这些结石形成者是美国儿童肾结石人群的代表，研究时的中位数年龄为15.6岁，结石诊断时为13岁，52%的女性和98%的白人。在肾结石患者中，59%的患者有复发性肾结石，68%的患者有家族肾结石病史。表2总结了抗生素暴露情况，补充表1和表2列出了研究人群的饮食摄入量和当前药物治疗情况。对照组中草酸（P＝0.05）、果糖（P＝0.03）和蛋白质（P＝0.04）摄入量较高，肾结石组中3～12个月内抗生素暴露率较高（P＝0.001）。36名肾结石患者和31名对照者出生后3年内接触抗生素的数据表明，肾结石的患者接触抗生素的比例也更高(P=0.03)。
2鸟枪基因组测序揭示肾结石儿童的分类和基因改变
肾结石患者和对照者的肠道微生物组的总体分类学特征与以前的研究相似，其中拟杆菌和梭状芽胞杆菌占大多数细菌种群（补充图1）。在拟杆菌中，普通拟杆菌在一个亚群中尤为突出，其丰度值大于40%。为了比较所有参与者的分类组成，我们在至少一个样本中测试了丰度大于0.1%的91个细菌类群。我们发现，在FDR调整后P<0.05的范围内，肾结石患者和对照者31个细菌分类群的丰度不同(图1A)。在确定的分类群中，与对照组相比，结石患者的所有分类群的数量都较少。包括7个产生短链脂肪酸丁酸盐的类群，包括几个蔷薇属和梭状芽孢属。丁酸盐生产途径中的关键细菌酶丁酰辅酶A脱氢酶的基因丰度在结石患者中较低（P = 0.02，图1B）。
测序还显示肾结石患者中三种降解草酸的细菌丰度较低：粪肠球菌、屎肠球菌和动物双歧杆菌。我们在对照组的两名受试者中检测到相对丰度较低的降解草酸物种产甲酸草酸杆菌（补充图1）。由于检测到的样本数量较少，因此产甲酸草酸杆菌的存在/缺失和相对丰度在肾结石患者和对照组之间均无差异。我们在所有对照组中以及除一名肾结石外所有其他患者均检测到草酸杆菌科的一小部分序列。草酸杆菌科植物丰度差异无显著性（P=0.4）。我们测试了草酸摄入量与细菌物种丰富度之间的关系，多次比较后发现没有相关性。甚至在进行多次比较之前，没有一种降解草酸盐的物种与草酸盐摄入量有关。我们将读取的序列与细菌基因序列数据库进行比对，并测试了草酰-CoA脱羧酶或甲酰-CoA转移酶（草酸降解涉及的细菌基因）的丰度差异（图1C）。我们发现这些基因的丰度在两组之间没有差异（P≥0.29）。
3肾结石患者粪便代谢与细菌丰度相关
我们进行了粪便样品的非靶向代谢组学研究，以鉴定可能与微生物组差异相关的代谢产物。与分类分析一样，肾结石患者和对照组之间的代谢物总体轮廓相似（图2A）。我们使用LDA来确定是否可以用代谢物的一个子集来区分这两组，发现线性判别法可以将肾结石患者与对照组区分开来(图2B)，准确率为77%。因此，我们在肾结石患者中发现了一个不同的粪便代谢物子集。
我们比较了代谢物的丰度，确定了18种代谢物在肾结石患者和对照组之间存在显著差异（图2C）。与对照组相比，结石患者体内10种代谢物含量更高， 8种代谢物含量较低。肾结石患者代谢最丰富的大多数代谢物均归类于氨基酸及其衍生物的途径下，肾结石患者代谢较不丰富的代谢物则为脂质和类脂质分子。
我们推测这些代谢物的水平可能与我们在研究中发现的细菌分类群的相对丰度有关。我们计算了代谢物与物种丰度之间的相关矩阵（图2D），该矩阵揭示了许多分类生物-代谢物对之间的强相关性。粪肠球菌与三种氨基酸衍生物以及其他代谢产物呈正相关。其他细菌种类与几种代谢物分别呈正相关和负相关。因此，我们发现了一组代谢物，这些代谢物能够区别肾结石组和对照组，并且与一组选定的细菌分类群高度相关。
图2 肾结石患者的粪便代谢组是不同的。（A）非靶向粪便代谢物的主成分分析。（B） LDA将肾结石患者与对照组区分开来，准确率为77%。(C)肾结石患者的代谢物增加(右)，减少(左)。(D)代谢物浓度与细菌丰度的相关性。星号表示显著相关。
4肾结石患者体内降解草酸盐细菌形成模块化网络
在我们的非靶向分析之后，我们重点研究了降解草酸盐的细菌，由于草酸钙肾结石的高发病率，降解草酸盐细菌在肾结石的研究中受到了相当大的关注。我们构建了本研究中检测到的降解草酸菌的丰度相关网络(图3A)，发现草酸降解菌群之间存在正相关关系，缺乏强负相关关系。该网络由两个模块组成：一个由相对高丰度的草酸降解类群组成，另一个由低丰度的乳酸杆菌组成（图3B）。在高丰度模块中，我们观察到，屎肠球菌与迟缓埃格特菌和粪肠球菌都相关。动物双歧杆菌也连接到粪肠球菌，但是没有附加到模块上。高丰度模块中的三个物种（屎肠球菌、粪肠球菌和动物双歧杆菌）在结石患者中为低丰度。此外，这些物种与区分群体的代谢物有关。因此，我们观察到草酸降解菌的一个模块以一种协调的方式变化，并跟踪代谢物的差异。
5肾结石患儿表现出独特的依赖年龄的菌群特征
正如预期的那样，通过丰富度（P＜0.001）和Shannon（P=0.01；Figure 4A）指数评估发现肾结石患者胃肠道丰富度更低。α多样性除了总体值较低，肾结石患者组中，α多样性表现出依赖年龄的特征，而在对照组中没有（图4B）。这种联系不是用简单的线性关系来描述的:肾结石患者的细菌多样性随年龄先减少后增加，9-14岁之间首次形成肾结石的个体，α多样性最低。相比之下,对照者微生物的α多样性在各年龄段相似,和年龄没有明显关联。
在一项探索性分析中，我们对细菌类群丰度进行了回归分析，以确定哪些细菌可能与肾结石患者中α多样性的年龄依赖性模式有关。我们测试了肾结石患者中相对丰度至少为0.1%的77个类群，发现13个类群与总α多样性相似（图4C）。对于这些分类群，未校正的P值与第一个结石年龄的线性或二次项相关，均＜0.05，但经FDR校正后，无显著相关。在我们的相关网络分析中鉴定出的两个物种，即大肠杆菌和屎肠球菌能够降解草酸盐。我们观察到年龄相关的物种和肾结石患者体内丰度较低的物种有部分重叠。
讨论
我们发现，患有草酸钙肾结石疾病的儿童和青少年肠道微生物组的多样性不如对照组，这与之前对成年人的研究一致。特别是，与对照组相比，患有草酸钙肾结石的儿童，产生丁酸盐的细菌和降解草酸盐物种的数量较少。此外，早发性肾结石患儿粪便中18种代谢物的水平与健康儿童相比也存在差异，主要是氨基酸和脂质超家族的代谢物。这些代谢物与粪便细菌相关，与对照组相比，肾结石患者粪便细菌数量较少。我们还确定了肾结石患者中微生物多样性的年龄依赖性，以及可能构成观察到的年龄依赖性模式的候选细菌。总的来说，我们的结果突出了肠-肾轴在早发性草酸钙肾结石疾病中的功能，并表明细菌的损失，尤其是那些产生丁酸盐和降解草酸盐的细菌的损失，可能协同作用以影响肠代谢并促进肾结石的形成。
草酸钙肾结石是肾结石最常见的形式，当钙和草酸盐在尿液中过饱和并结晶时就会发生。迄今为止，肾结石的评估和治疗主要集中在肾脏，而不是可能影响尿液化学和其他结石形成介质的上游紊乱。肠-肾轴代表了肠道微生物群、肠道代谢物、尿液代谢物和尿液化学物质之间的潜在因果途径。在肾结石疾病的背景下，这个轴提供了一个框架来理解扰乱肠道微生物组组成可能如何对肠道和尿道产生下游影响。我们的研究小组最近证明，接触某些口服抗生素会导致肾结石发生几率增加1.3到2.3倍。年轻时接触抗生素的风险最大，这与早期接触抗生素比晚期接触抗生素对宿主代谢的影响更大的报道一致。在本研究中，先前的抗生素暴露在肾结石患者中也更高，这为抗生素暴露、肠道失调和肾结石之间提供了一个潜在的联系。
除了肠道微生物总体多样性降低外，鸟枪宏基因组学还揭示了草酸钙肾结石早期患者细菌代谢改变（丁酸盐产量减少和草酸盐降解减少）的两个特征。形成肾结石的人体内产生丁酸盐的微生物数量较少，包括Roseburia，它占肠道微生物组中所有细菌的1%，对饮食摄入特别敏感。丁酸是一种短链脂肪酸，是炎症介质，重要的是，它有助于维持肠粘膜屏障，调节肠道中SLC26草酸转运体的表达。丁酸盐的这些功能表明，丁酸盐产量的减少将增加肠道中草酸盐的吸收并导致尿中草酸盐的排泄增加。我们还发现降解草酸细菌的丰度较低，即粪肠球菌、屎肠球菌和动物型双歧杆菌。这三个类群是草酸降解网络的一部分，其中包括乳酸杆菌属中丰度较低的类群。但是，我们没有发现产甲酸草酸杆菌的丰富度存在差异。产甲酸草酸杆菌是一种厌氧革兰氏阴性细菌，由于其使用草酸盐作为碳和能源而备受关注。Miller等人也报道了一个与成年人降解草酸盐有关的微生物网络，包括瘤胃球菌、双歧杆菌和示波螺菌。与我们采用的非靶向方法相比，他们把重点放在了与草酸盐稳态有关的微生物网络(与草酸杆菌属或在啮齿动物模型中受草酸盐刺激的类群有关)的分析上。
我们样本中草酸细菌的缺乏可以解释研究之间草酸降解网络组成的差异，儿童和成年人肠道微生物组的差异也可以解释。最近的一项研究发现，与降解草酸有关的细菌基因在成人肾结石患者的粪便中含量较少，而且这些基因在几种细菌中都有表达(但不包括草酸杆菌)，其累积丰度与尿草酸盐排泄呈负相关。虽然我们的研究没有确定基因丰度的总体差异，但我们确定了几种较低丰度的降解草酸的物种，这表明患有肾结石的儿童体内降解草酸功能的依赖物种差异。总之，这些结果表明，降解草酸菌群可能影响草酸钙结石的发生发展。
我们在患有肾结石的儿童中发现了强有力的肠道代谢紊乱的证据。尤其是18种代谢物在病例和对照组之间存在差异，肾结石患者中10种代谢物含量较高，8种代谢物含量较低。肾结石患者体内代谢产物多为氨基酸或衍生物超家族，而不太丰富的代谢产物多为脂质超家族。粪便代谢产物的这些差异在很大程度上由早发性肾结石病个体中31种特定细菌类群的丰度较低所解释，其中油酸盐/疫苗是唯一与任何细菌类群无关的代谢产物。这些代谢物将有助于未来的研究，以确定扰乱肠道微生物组的外部暴露与肾结石之间的因果关系。
我们的研究结果首次为早发性肾结石患者肠道微生物组的改变提供了证据，也首次为任何年龄的草酸钙肾结石患者肠道代谢组的改变提供了证据。本研究也是首次利用鸟枪基因组学对肾结石患者的肠道菌群进行研究，与16S核糖体RNA测序相比，提高了细菌鉴定的分辨率和生物学功能。该解决方案使我们能够根据疾病发病年龄调查肠道微生物组多样性的总体差异和物种差异。特别是，在9 - 14岁首次形成肾结石的儿童中发现的微生物多样性最低，13个类群与肾结石的发病年龄有关。我们对照组中没有发现年龄和多样性之间的联系。这些结果与我们先前的研究一致，该研究表明肾结石的发病率在10岁时开始增加。我们假设，微生物多样性的最低点可能会增加对其他已知暴露物的敏感性，这些暴露物会增加突发肾结石的风险，比如饮食中钠摄入量的增加或液体摄入量的减少。虽然还需要更多的研究来跟踪肾结石的儿童的年龄相关性，但我们已经确定了一组值得进一步研究的候选细菌。
我们的研究结果有助于理解肾结石发病率的增加和发病年龄的提前。这种变化的速度表明，外部因素的变化(可能是可修改的)正在推动这种变化。传统的肾结石的危险因素，如低液体摄入量，似乎不太可能显著地改变了这一点，导致在过去二十年中肾结石的发病率增加了70%，儿童期发病率也在上升。然而，抗生素的使用在这段时间内有所增加。2011年，美国开出了超过2.5亿个抗生素疗程，其中对10岁以下儿童和妇女使用抗生素的比例最高。儿童接受的抗生素比任何其他年龄组都多，30%的抗生素在门诊治疗期间是不合适的。未来的研究应该确定在早期肾结石病的肠道微生物组和代谢组中发现的差异是否是由于抗生素暴露所致。如果在其他研究中得到证实，我们发现的独特的微生物群落及其相关功能可能导致肾结石预防的新疗法。例如，最近的小鼠研究表明，下调NLRP1介导的炎症小体途径可以扩大产生丁酸的生物体群落，这可能有助于预防炎症性肠病。
我们承认这项研究有几个局限性。在所有的观察研究中，可能有不可测量的混杂和偏倚。我们通过匹配年龄、性别、种族和从同一个健康系统中招募参与者来减少选择偏倚。我们还对参与者进行了广泛的表型分析，并收集了有关影响微生物组的抗生素和其他暴露信息（例如饮食和其他药物）。然而，对依赖自我报告/面谈收集的某些药物暴露信息是一个限制。尽管当前的样本量太小，无法确定饮食和抗生素如何干扰肠道微生物组和代谢组并影响肾结石疾病，但我们目前正在扩大人群以进行这些中介分析。形成肾结石的人，特别是有肾结石家族史的儿童，也有可能在肠道生理上有遗传差异，影响微生物组和代谢组，作为观察到的差异的另一种解释。第二，本研究无法评估结石形成前微生物群的结构和功能。第三，微生物组数据是高维的，因此需要特别考虑以减少虚假结果。此外，许多物种和生化物质很少出现在微生物组和代谢组数据中。因此，在进行多项测试时，我们控制了预先指定的FDR，未测试稀有物种，并通过排列测试确认了分类群-代谢物关联的重要性。第四，在非靶向代谢组学分析中，不能直接测定挥发性丁酸盐。我们也没有分析尿液微生物群或测量尿液代谢物和化学成分。今后的研究应将分析扩展到尿液，以检查肠道微生物群干扰对肾脏的影响。最后，对照组未获得影像学检查。因此，有些人可能有无症状的结石，据报道在4％的成年人中发现了这些结石，但在儿童中很可能不常见。对照中结石的存在会使结果偏零，并使我们可能低估了与肾结石形成的关联。肠道细菌的丧失，特别是那些产生丁酸和降解草酸的细菌，与代谢紊乱有关，代谢紊乱可能是早期肾结石疾病的上游决定因素。
总结
原文网址：https://doi.org/10.1681/ASN.2019101131