基于单细胞RNA测序技术揭示与疾病进展和免疫相关的急性髓系白血病的层级分型
1. 导读
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种侵袭性的血液肿瘤，其特征是髓系未成熟细胞的聚集。尽管大多数患者最初对化疗有响应，但仍有近75%的患者复发，并在确诊后5年内死于该疾病。研究者尝试将AML的复发与基因耐药克隆联系起来，但效果甚微，这引起了人们对非基因驱动的功能异质性的兴趣。AML的进展受微环境中正常细胞的影响，机体的免疫系统可以限制肿瘤细胞的扩张，直到逃避或抑制宿主免疫的细胞亚群出现，在错综复杂的微环境中了解不同细胞类型如何促进疾病的进展是十分困难的。本研究将单细胞RNA测序和基因分型技术相结合，对来自40份骨髓抽提样本中的38410个细胞进行了分析，其中包括16名急性髓系白血病患者和5名健康志愿者。接着，研究者利用机器学习分类法来区分恶性细胞类型的谱系，这些恶性细胞类型的丰度在患者之间和同一肿瘤的亚克隆之间有所不同。细胞类型组成与样本的遗传性病变相关，包括有丰富类祖细胞的FLT3-ITD突变。原始的AML细胞表现为转录功能紊乱，并伴有干细胞和髓样启动基因的共同表达，具有预后意义。分化的单核细胞样AML细胞可以表达多种免疫调节基因，并且在体外抑制T细胞活性。该研究利用单细胞技术挖掘了有关AML细胞状态、调控因子和生物标志物的图谱，为AML的精确治疗提供了参考。
2. 论文ID
原名：Single-Cell RNA-Seq Reveals AML Hierarchies Relevant to Disease Progression and Immunity
译名：基于单细胞RNA测序技术揭示与疾病进展和免疫相关的急性髓系白血病的层级分型
期刊：Cell
IF：31.398
发表时间：2019.3.7
通讯作者：Bradley E. Bernstein
通讯作者单位：哈佛医学院麻省总医院
DOI号：10.1016/j.cell.2019.01.031
3. 实验设计
本研究中，作者首先使用基于高通量纳米孔技术，对健康人骨髓样品中细胞群体进行鉴定。同时，从骨髓样本中提取单细胞的转录和突变数据。接着，通过scRNA-seq测序技术，分析了16例AML患者的30712个细胞和5例健康供体的7698个细胞，并获得了3799个细胞的基因分型信息。接着，作者将这些数据集成到一个机器学习分类器中，该分类器可以区分恶性肿瘤和恶性肿瘤正常细胞和6种恶性AML细胞类型沿着HSC向髓样分化轴投射。研究者利用这一技术将发育层级与基因型关联起来，评估原始AML细胞的特性和预后意义，并识别具有免疫调节特性的分化AML细胞。
4. 实验内容
4.1 健康人骨髓样品中细胞群体的鉴定
为了表征健康人骨髓样本中的细胞多样性形态基准，研究者使用基于高通量纳米孔技术，对来自四个健康供体（21-56岁）的冻存细胞和来自第五个供体（CD34 + CD38-和CD34 +）的富集前体细胞进行scRNA-seq分析，共获得7698个健康供体骨髓样本来源的高质量数据。该研究利用BackSPIN聚类法来区分细胞类型，获得15个主要细胞群，包括造血干细胞和祖细胞，以及多发性髓系、红系及淋巴系细胞群。对正常骨髓样本进行的scRNA-seq测序分析揭示了不同的造血细胞类型，这与当前的关于造血细胞分化轨迹的观点相一致。
图1健康人骨髓样品中细胞群体的鉴定。A. 针对来自正常骨髓样本的6,915个造血细胞的scRNA-seq数据的BackSPIN聚类鉴定了具有相似转录状态的31个细胞簇；B. 热图显示了55个选定的细胞类型特异性基因(行)在6195个单细胞中的表达，按自旋自旋定义的簇(列)排序；C. 5个正常骨髓样本中由BackSPIN算法定义的细胞类型比例分布；D. 6,915个单细胞转录组的KNN可视化分析，相似的细胞(点)位置更接近，点由图C中的细胞类型注释进行颜色编码；
4.2 AML肿瘤微环境的单细胞分析
为了检测AMLs的细胞多样性，研究者从16例AML患者的诊断和治疗过程中获得了35份冷冻保存的骨髓抽提液。在该队列中，所有样本的靶向DNA测序均显示了符合预期的突变频率，包括DNMT3A(44%)、FLT3(31%)和NPM1 (31%)。接着，研究者对得到的这35个样品在没有富集的情况下进行了scRNA-seq 分析，以达到一个较宽的维度的关于AML肿瘤微环境的概述。
图2 AML肿瘤微环境的单细胞分析。A. 急性髓系白血病患者和骨髓样本收集的概述，细胞数量反映了通过质控的单细胞转录组数据，对于每个病人，饼状图显示了样本收集的时间及有关诊断和临床干预治疗计数；B. 队列研究中通过靶向DNA测序和细胞遗传学技术，检测到的基因改变(红色)；AML556 (C)或AML707B (D)的收集到的单细胞数，每张图显示来自指定时间点(红色)和其他时间点(灰色)的细胞。
4.3 通过Short-Read和纳米孔测序技术进行单细胞基因分型
本研究中，使用Seq-Well扩增和测序包含AML突变的部分转录本，利用全转录组扩增的优势，产生3’ 端附有细胞编码的全长cDNAs。上述排序使其能够将突变状态覆盖到scRNA-seq的数据上。研究者将突变特异性单细胞基因分型应用于35个AML样本，成功地在43个目标位点中的27个位点检测到了野生型和/或突变体转录本。同时检测了16名患者中的14名患者的转录本，平均每个患者有355个转录本对应258个细胞。研究者提出了放大AML中频繁突变基因的转录本编码的方法，从而对样本进行单细胞水平的基因分型。
图3通过Short-Read和纳米孔测序技术进行单细胞基因分型。A. 从单个细胞获取转录和基因型信息的示意图；B. 利用short-read Illumina测序技术分析单细胞基因分型突变的频率；C. 散点图比较了来自DNA测序(y轴)或单细胞基因分型(x轴)的突变频率；D. 基因组序列显示了AML328中三个选定的TP53转录本的纳米孔长片段，每个转录本显示100个reads (reads由CB和UMI匹配，表明它们来自相同的转录本)；E. 条形图显示通过short-read (灰色)、纳米孔测序(绿色)或两者结合(红色)检测到的野生型或突变型TP53转录本的数量；F. 基因组序列显示纳米孔读取AML328中两个选定的FLT3转录本，每个转录本显示与ITD或野生型等位基因对应的100个reads。G. 基因组序列显示纳米孔读取从AML707B到RUNX1T1(左)和RUNX1(右)位点的融合转录本; AML556 (H)和AML707B (I)显示通过Illumina测序技术进行单细胞基因分型，检测野生型(蓝色)或突变型(红色)的转录本；J. AML707B显示了通过纳米孔测序技术检测到的RUNX1-RUNX1T1融合转录本(绿色)的细胞。
4.4 机器学习分类器区分恶性细胞和正常细胞
在本实验中，研究者整合了所有患者的单细胞突变信息和转录组信息，目的是用来区分恶性细胞和正常细胞。首先，选择所有单细胞基因分型检测到评估基因突变的AML细胞。接着，使用随机森林机器学习算法，根据这些假定的恶性细胞与所有15种正常骨髓细胞类型的相似性，对它们进行分类。总共检测到13489个恶性AML细胞，任何一种被归为恶性的单细胞比例均与临床上相符，这些数据支持研究者鉴别恶性肿瘤方法的准确性。
图4机器学习分类器区分恶性细胞和正常细胞。A. 机器学习分类器用于预测AML细胞类型(分类1)和区分AML肿瘤中恶性细胞与正常细胞(分类2)的示意图；B. 单细胞转录组的KNN可视化分析，通过检测AML样本中野生型或突变型转录本细胞，根据其与正常细胞的相似性，将其投射到上图中，投射细胞的密度是根据野生型和突变型转录本的比例来着色，同时带有突变转录本的细胞(红色)沿着HSC向髓样分化轴投射；C. 利用第一个随机森林分类器对AML细胞中的突变转录本进行分类； AML556 (D)和AML707B (E)中细胞颜色根据分类情况标记为恶性(红色)或正常(灰色)；F. 对5个代表性肿瘤样本中所有恶性细胞(列)的细胞类型进行预测得分(行), 图片下方显示的是检测到野生型和/或突变转录本的细胞，或表达细胞周期特征基因的细胞；H. 正常骨髓样本中单细胞转录组的KNN可视化分析，根据AML细胞与正常细胞的相似度，将AML样本中的恶性细胞投射到上图；I.利用流式细胞仪对 AML样本中髓样分化标志物的表达情况进行分析；
4.5 AML细胞层次分类结构与潜在的遗传突变相关
研究者通过对纳米孔测序序列的分析，将每个突变分配给一个不同的等位基因，第四个等位基因是野生型。虽然在相同的细胞中检测到FLT3- ITD和FLT3- A680V转录本，但FLT3-N841K突变从未与同一细胞中的其他突变等位基因同时发生。综合遗传和转录组分析表明，AML419A含有以原始细胞为主的FLT3-A680V/ITD亚克隆和以分化细胞为主的FLT3-N841K亚克隆。同时，这两个亚克隆聚集在具有相似转录状态的细胞上，但它们的比例并不不同。
图5 AML细胞层次分类结构与潜在的遗传突变相关。A. 基因组序列图显示来自AML419A样本中的四个选定的FLT3转录本的纳米孔测序reads，每个转录本显示100个reads，黑色箭头表示用于扩增的引物的位置；从单细胞突变(B)的共同发生和批量DNA测序的VAFs (C) 推断出来的AML419的进化关系；D. FLT3蛋白结构域和突变位点; E. 来自AML419A样本中，40个单细胞中的6种恶性细胞类型的180个特征基因的表达情况；F. 利用RNA-seq技术推算AML样本中6种恶性细胞类型的180个特征基因的表达情况；G. 该图显示(F)中AMLs的染色体畸变(顶部)、突变(中部)和FAB分类(底部)，细胞类型组成与遗传之间的对应关系在图中是显而易见的；H. 流式细胞术显示用FLT3-WT、FLT3-D835Y、FLT3-ITD或对照基因(荧光素酶)转导4天后， MUTZ-3细胞中原始细胞标志物CD34的表达情况；I. 该图显示CD34+细胞在FLT3变异转导后的百分比变化；
4.6 恶性祖细胞转录程序的失调
接下来，研究者将研究重点转向原始的AML细胞类型，这种细胞类型能够促进肿瘤的生长。结果发现，与正常AML细胞相比，原始AML细胞上调了参与应激反应和氧化还原信号(XBP1, GPX1)、增殖(FLT3, PIM1, MYC)和自我更新(HOXA9, BMI1)的基因。同时，也评估了优先表达的表面标记，因为这些表面标志物为靶向治疗提供了机会。该结果突出强调了已建立的LSC标记，如CD96、CD47和IL1RAP，以及其他候选标记，如CD36和CD74 (MHCI-恒定链)。
图6恶性祖细胞转录程序的失调。A. 散点图定位基因在恶性HSC/Prog样细胞中的优先表达(x轴)，以及与恶性细胞中HSC/Prog预测评分的相关性(y轴)，右上角的基因相对于正常祖细胞和其他恶性细胞类型，在恶性HSC/ prog样细胞中优先表达(红色)；B. 热图显示表面标记物在正常骨髓细胞或诊断急性髓系白血病的恶性细胞中的表达。C. 热图显示正常骨髓样本或恶性AML细胞中HSC/Prog、GMP或分化髓样细胞(n = 90)的衍生特征基因表达，细胞按其分类器预测得分排序；D. 30个健康骨髓样本来源的HSC/Prog信号基因与正常细胞和恶性细胞GMP预测评分的相关性研究；E. 热图显示60个特征基因在179个AML图谱中的表达情况；F. Kaplan-Meier 曲线显示HSC/ prog评分较高的患者预后较差；
4.7 AML来源的单核细胞样细胞具有免疫调节特性
原则上，T细胞可以消除AML细胞，这一点可以通过干细胞移植后，对白血病产生持久治疗的能力得到证明，但在AML中可能会受到损害。因此，研究者检查了单细胞数据中的T细胞。在正常骨髓样本中，鉴定了两个T细胞亚群，naive T 细胞(IL7R, CCR7)和CTLs细胞 (CD8A, GZMK)，以及NK细胞相关群体(NCAM1/CD56, KLRD1)。研究发现，与正常对照组相比，急性髓细胞白血病骨髓抽提物中，T 细胞和CTLs细胞的比例更低。此外，使用免疫组织化学对另外15例诊断性AMLs和15例正常骨髓样本的CD3+ T细胞、CD8+ CTLs和CD25+FOXP3+ T-regs进行定量，也发现同样趋势。因此，scRNA-seq和免疫组织化学都揭示了T细胞数量和组成的一致性，表明在AML中，存在免疫抑制的肿瘤微环境。
图7 AML来源的单核细胞样细胞具有免疫调节特性。A. KNN可视化分析显示，所有的T细胞和NK细胞在正常骨髓和AML样本中可以被鉴定，BackSPIN分析可以区分表达naive T细胞、CTLs或NK细胞；B. 利用scRNA-seq技术从4例正常骨髓样本及16例诊断性AMLs中，注释为T细胞或CTLs细胞的相对数量； C. 利用scRNA-seq技术从2例正常骨髓样本和6例诊断性AMLs中（>50 T / NK cells）中，注释为naive T细胞或CTLs细胞的相对数量； D. 正常骨髓样本和AML患者样本中T细胞 (CD3) 和CTLs (CD8) 的免疫组化染色分析及H&E 染色分析；E. 免疫组化染色中T细胞和CTLs的定量分析；F. 免疫组化染色中CTLs (CD8+) 、T-regs (CD25+FOXP3+) 等T细胞的定量分析，AML患者具有较少的T细胞和CTLs，但T-regs数量较多，该趋势与免疫抑制微环境相一致；G. 该图显示AMLs样本中2385个恶性单核细胞样细胞(红点)及正常骨髓样本中567个单核细胞(黑点)； H. 体外用CD3/CD28微球刺激CD4+ T细胞系的活化；I. 体外CD3/CD28微球刺激原代CD4+ T细胞的活化， CD69阳性细胞用于检测T细胞活化情况；J. 用类似H图中的方法活化CD4+ T细胞系，该实验在10万个CD34+或CD14+ MUTZ-3细胞的存在下进行；K. 用类似H图和J图中的方法活化CD4+ T细胞系，该实验从正常骨髓样本 (n = 6个供体) 或AMLs样本中的10万个富集CD14 -或CD14+原代细胞的存在下进行；L. 正常骨髓单核细胞和AMLs单核细胞样细胞中免疫调节基因的表达情况；M. Kaplan-Meier 曲线显示按MRC1/CD206或CD163表达水平分类的179例AML患者的生存期；
5. 结论
本研究首次利用单细胞转录组学和基因分型技术来解析AML高度异质性的微环境。该研究结果提供了对原始AML细胞异常调控机制的深入了解，识别了具有免疫抑制特性的分化AML细胞，同时揭示了发育层次与肿瘤遗传背景之间的对应关系，上述数据和发现可以指导后续针对恶性肿瘤的关键基因和特定成分的治疗策略。
6. 评论
早在20世纪60年代，急性髓系白血病的瘤内异质性就已经得到研究者的重视，但直到最近才有机会利用高维单细胞测序分析技术，来研究肿瘤的复杂性。在文中，研究者结合scRNA-seq测序技术和基因分型来描述AML的肿瘤生态系统，用来区分恶性细胞和正常细胞，并阐明细胞的亚克隆类型。该研究确定了从HSC到髓样分化轴的6种恶性细胞类型，它们的丰度在不同基因型的AML之间存在很大差异。本研究提供了强大的单细胞测序技术，丰富的单细胞资源转录组，并深入了解AML的层次结构、LSC程序和肿瘤免疫相互作用。同时，建立了将高通量scRNA-seq测序与反复突变AML基因的单细胞基因分型相结合的方法，来应对AML复杂的肿瘤生态系统。虽然AML研究通常集中在具有自我更新能力的原始细胞类型，但作者发现，分化的恶性细胞也对AML生物学有贡献。综上所述，本文结合转录组学和对急性髓系白血病患者单个细胞的突变分析，揭示了不同功能亚群及其相关驱动因素的存在，为AML的精准分型及治疗提供了参考。
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