观点 | 单细胞分析以了解驱动疾病发病机理的免疫细胞类型的多样性（一区：IF=14.11）
编译：罗睺，编辑：十九、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
论文ID
原名：Single-cell analysis to understand the diversity of immune cell types that drive disease pathogenesis
译名：单细胞分析以了解驱动疾病发病机理的免疫细胞类型的多样性
期刊：Journal of Allergy and Clinical Immunology
IF：14.11（一区）
发表时间：2019年11月
通讯作者：Gregory Seumois博士
通讯作者单位：美国加利福尼亚州拉荷亚免疫研究所
综述内容
与许多肺病风险相关的遗传变异影响人体内免疫细胞类型的神经特异性亚群的基因表达。免疫系统包含抵抗传染源所需的多种细胞类型。同时，免疫细胞可能会过度反应，导致过敏、哮喘、自身免疫和炎症性疾病。这对人类健康有更广泛的影响，然而，仍然缺乏对免疫细胞类型的多样性及其有助于疾病发病的特性的全面了解。
高通量测序（NGS）是了解健康和疾病中生物过程的最新、最强大的工具之一。基因组，表观基因组和转录组的研究为遗传变异和环境信号如何扰动特定细胞类型中的基因表达和染色质结构如何驱动疾病发病机理提供了无偏见的信息。在特定类型的细胞高度相似的假设下，通常对细胞群进行基因组测定，例如RNA测序（RNA-seq）和微阵列。但是，最近有关单细胞研究的证据表明，这种假设是不正确的。同一种群中的单个细胞可能会出现巨大差异，这些差异可能会对整个细胞种群的功能产生重要影响。
NGS在单细胞转录组和表观基因组分析中的应用使生物学家能够从健康和患病组织中存在的每个细胞中收集到前所未有的信息量。对患有肺部疾病（例如过敏，哮喘，慢性阻塞性肺疾病，肺纤维化，肺结核和支气管扩张；图1）的患者的血液、呼吸道和肺部样本中的单个免疫细胞的研究将有助于更好地定义驱动疾病发病的免疫细胞类型，并帮助研究者以“无假设”的方式理解细胞异质性和分子可塑性的程度，这些方法可以解决目前存在的关于病理或保护细胞群体的“分子状态”的重大挑战。
图1：单细胞NGS使用的是来自呼吸道和肺部疾病患者的临床样本。
上图提供了流程的概述。从患者中采集的临床样本将通过分离细胞部分进行处理，并用识别细胞表面标记的抗体混合物与荧光色素（用于流式细胞仪分析）和/或DNA条形码寡核苷酸（用于使用NGS测序进行免疫表型分析）进行染色。根据所需的细胞数量和输出数据集，染色细胞将通过两个单细胞测序平台选项进行分类和处理：基于PCR板的带Smart-seq2库制剂的分类细胞或基于液滴的10X平台。
下图显示了选择提供最高分辨率（每个细胞的基因数）的单细胞测序方法的重要性。如果使用有限数量的细胞，每个细胞检测到的基因数量越高，聚类分辨率就越高，并且有可能分离出具有新分子特征的细胞。COPD，慢性阻塞性肺疾病；CyTOF，大规模流式细胞仪。
疾病状态下的免疫应答失调是否与血液/肺组织中已经生理存在的具有致病特性的新细胞亚群的发展或优先存在的免疫细胞亚群的优先扩张/收缩有关（图2）？在人类受试者和模型生物中对慢性疾病进行的多项研究报告了获得混合表型的免疫细胞的存在。例如，在潜伏性结核患者中，对结核分枝杆菌抗原产生特异性应答的T细胞同时具有TH1和TH17的特征。同样地，在过敏和哮喘患者中，已鉴定出具有致病特性的TH2细胞。然而，只有在单细胞分辨率下进行的研究才能使科学家们确定这些“疾病特异性”的功能特征是预先存在的细胞群的扩展或响应于环境信号的分化结果。
图2：使用单细胞分析提供的信息的示意图。
上图显示了健康受试者4个免疫细胞亚群的分布。
下图显示了在疾病状态下发生的可能性：一个细胞亚群的相对比例增加，而不改变分子程序（定量变化）和/或一个亚群中的细胞改变其分子程序（定性变化）；这种差异可以通过单细胞分析来捕捉。
单细胞组学分析作为发现工具的功能已在癌症免疫学领域得到了很好的证明。就在过去的两年中，许多研究报告了几种人类癌症类型中肿瘤微环境的单细胞组学分析。这些研究已成功鉴定出新的免疫细胞亚群，新的免疫逃逸和效应子机制，以及潜在的重要分子靶点，用于癌症免疫治疗。例如，研究人员最近对肺癌患者的单细胞研究已经发现了一种高功能的组织驻留记忆T细胞亚群，可能是白细胞死亡蛋白1（PD1）治疗的靶点。此外，它还定义了许多新的分子，这些分子可能对调节该亚群的功能以获得更好的抗肿瘤免疫反应非常重要，抗PD1治疗前后的对肿瘤样本单细胞分析，揭示了区分免疫治疗应答者和非应答者的潜在机制和生物标记物，癌症领域的研究强调，对病变组织样本的单细胞分析可以提供与驱动疾病的关键致病机制相关的信息，并帮助研究人员了解新干预措施的作用机制。
从标准诊断或治疗程序中比较容易获得多余的肿瘤组织样本，使得研究能够在大量细胞和患者样本中快速进行单细胞研究。然而，对于哮喘和慢性阻塞性肺疾病等肺部疾病患者，获取呼吸道组织样本并不是常规的临床实践。加上可用于研究目的的组织数量有限，这可能解释了肺病患者中单细胞研究的相对匮乏。解决这一局限性的一种方法是研究模型生物中的肺部疾病。例如，通过对体内气管上皮细胞发育的单细胞分析，发现了肺纤维化背景中新的细胞类型和细胞谱系。最近，在由屋尘螨过敏原暴露驱动的哮喘小鼠模型中，Tibitt等人的研究表明，发炎的肺组织辅助性T细胞比通常接受的异质性更高。但是，呼吸道和肺部疾病是长期存在的疾病，小鼠模型仅捕获了复杂的人类生物学的一部分。因此，人类研究有可能为疾病病理学提供更深入的见解。
研究具有低细胞数量的人体组织样品的一个重要技术限制是，用于单细胞分析的最常用的高通量平台需要数千个细胞作为输入材料。仅具有几十到数百个细胞的样品将需要另一种方法，该方法依赖于在单细胞文库制备后通过在96孔板中使用流式细胞仪进行单细胞分选（图1，上图）。迄今为止，最成功的方法是根据Smart-seq2协议优化的单细胞RNA-seq文库制备方法。与索引排序结合使用时，也可以并行获取高维蛋白质表达数据。这种方法虽然手工制备很费力，但它使研究人员可以查看分类到板中的每个单个细胞的完整表面表型，并将该事件与其转录组联系起来。另一种方法是由10X基因组公司商业化的基于液滴的单细胞RNA序列分析，如一项比较研究所示，Drop-seq分析产生的分辨率较低，这使得计算分析变得困难，尤其是在分析高度相似的细胞子集（例如T细胞子集），例如PBMC（图1，下图）。与商用Drop-seq分析（10X Genomics）相比，Smart-seq2分析可检测到两倍数量的基因。在单个基因的水平上，两种测定对高表达基因（例如B2M）的敏感性相似。但是，对于一些感兴趣的基因，使用10X基因组学只能表达30％至40％的细胞表达，而使用Smart-seq2分析法则可以显示85％至95％的细胞表达。
在2019年初，10X Genomics发布了更新版本的mRNA捕获率更高（分辨率）。当与样本多路复用相结合时，使用DNA寡条形码抗体或DNA寡条形码脂质锚定在细胞膜。这种测定方法，将能够以经济高效的方式研究呼吸道和肺组织样品，且分辨率更高。
最近，描述细胞表观遗传状态的NGS分析也可用于研究细胞数量有限的临床样品。这种单细胞表观遗传学方法包括使用免疫沉淀和测序（sc-ChIP-seq）进行组蛋白修饰分析，或使用高通量测序（sc-ATAC-seq）对转座可及染色质的分析进行更易获得和更具成本效益的分析。这些分析将完成理解细胞异质性以及响应病原性扰动的细胞分化或激活机制所需的工具库。
总而言之，对从肺部疾病患者的血液、呼吸道和肺组织样本中分离出来的免疫细胞进行单细胞高维免疫表型分析，RNA测序和染色质可及性分析，将为深入了解驱动健康和疾病状态的分子和细胞机制提供参考。这些方法很可能成为未来精密基因组医学领域诊断工具、新生物标记物和治疗干预措施发展的主要措施。
更多推荐
1 科研 | 基于转录组和调控网络分析揭示了石斛降血糖作用及其机制（国人二区作品）