科研 | SBB：长期施用有机肥增加了土壤有机质和团聚体的形成，改变了微生物群落结构和关键类群
编译：gu作成熟，编辑：小菌菌、江舜尧。
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微生物在土壤有机质（SOM）的形成和分解中起着关键作用。有机肥对SOM的积累、团聚体的形成以及微生物群落组成和共生网络起着至关重要的作用。
本文中，作者研究在Ultisol陆地连续施加27年矿物和/或有机肥后（稻草，花生秸秆，萝卜，猪粪的肥料），观察对四种粒径团聚体中的原核和真菌群落及其共现网络的影响。有机肥料和团聚体粒径大小对团聚体中的SOM具有主要影响和交互影响(p<0.001)。团聚体的粒径大小造成了SOM含量的最大差异（43%），更多的SOM积累在大团聚体中（> 250 μm）与微团聚体(< 250μm)相比。团聚体粒径大小的增加通过增加Rhizobiales和减少Eurotiales种群来影响原核生物和真菌的群落结构。由于对底物的偏好，小分子团聚体（<53μm）中的沙门氏菌和线虫尤其丰富。有机肥料对微生物群落结构的调节作用超过团聚体粒径的大小的影响，分别占原核和真菌群落变异的41％和29％。猪粪的施入对SOM含量和聚集的影响最大，对微生物群落结构的影响比对植物残渣的影响更大，主要是通过增加Bacillales, Gaiellales and Pezizales种群，以及减少Thermogemmatisporales菌群实现这种影响。猪粪肥料所表现出的这种作用与施入猪粪后有效增加了SOM含量和pH有关。
网络分析显示，微团聚体中微生物组间的正、负线性关系明显多于大团聚体，表明在有利生态位较少的微团聚体中（顽固性较高的SOM和较不稳定的SOM），微生物之间存在较强的协同和拮抗作用。Thermogemmatisporales是土壤中最具影响力的关键类群(相对丰度约为4.9%)，随着大、微团聚体中SOM含量的增加，其丰度迅速下降。因此，微生物群落结构依赖于聚集体的大小，在采样时应考虑这一点。总体而言，长期施用有机肥增加了有机质的含量和聚集，改变了原核真菌群落结构和重点类群。
论文ID
原名：Long-term manure application increases soil organic matter and aggregation, and alters microbial community structure and keystone taxa
译名：长期施用有机肥增加了土壤有机质和团聚体的形成，改变了微生物群落结构和关键类群
期刊：Soil Biology and Biochemistry
IF：5.29
发表时间：2019.07
通讯作者：丁维新
作者单位：中国科学院南京土壤研究所土壤与可持续农业国家重点实验室
实验设计
1 研究地点和土壤取样
长期试验始于1988年4月鹰潭红壤生态试验中国科学院站(北纬28°15′20”，东经116°55′30”).夏花生连作，冬休耕.土壤属于典型的网纹湿老成土(Ultisols),由25.6%的砂土、33.2%的淤泥和41.2%的粘土组成. 本实验中，共设计了5组处理分别为，矿物氮磷钾肥料(NPK)、矿质NPK肥料+花生秸秆(NPK+花生秸秆)、矿质NPK肥料+稻草(NPK +稻草)、矿质NPK肥料+萝卜渣(NPK +萝卜渣)、矿质NPK肥料+猪粪(NPK +猪粪)。氮磷钾的年施肥量包括尿素120kg N ha−1，磷酸钙镁30kg P ha−1，氯化钾90kg K ha−1。在NPK +花生秸秆组、NPK +稻草组、NPK +萝卜渣组和NPK +猪粪组中，30%的无机氮肥被有机氮肥替代。各施肥处理全氮、全磷、全钾量相同，将磷酸钙、磷酸镁、氯化钾改为有机肥处理，达到全磷、全钾量相同。
在2014年12月13日，使用直径为10cm的不锈钢土壤采样器，在每个地块的耕作层(0 - 20cm)随机采集10份完整的土壤样本。每个地块的所有样品都被仔细混合，形成一个复合样品，并在一个装有冰的恒温箱中运送到实验室。用钳子小心地取出可见的石头和植物残体。沿着天然的断点将土壤轻轻分离，通过一个8毫米的筛子，然后分成三个子样本; 一份样本被筛选到小于2毫米，并立即储存在- 80°C，以便随后提取DNA;另一份风干后用于测定土壤性质;第三份样本立即用于团聚体的分离。
2 土壤团聚体分离
根据Elliott (1986)将土壤团聚体分为四类; > 2000μm（大型宏观聚集体），250–2000μm（小型宏观聚集体），53–250μm（大型微团聚体）和<53μm（小型微团聚体）。简而言之，将100 g潮湿的土壤（在烘干的基础上）浸入2000μm筛子上方的去离子水中。摇动5分钟后，用手将筛子上下移动50次，每次移动3厘米，持续2分钟。收集残留在筛子中的馏分。然后将水和<2000μm的土壤倒入250μm的筛子中，然后倒入53μm的筛子，并重复筛分步骤。收集残留在250μm筛子和53μm筛子中的馏分。将通过53μm筛子的水加土壤转移到250 ml离心管中，在4°C下进行离心（5000 rpm，30分钟），并弃去上清液。分离后，每个馏分中其中一部分样品用于测定水分含量，另一份样品在50°C下干燥，称重并用于SOM分析，第三份样品冷冻干燥以进行DNA提取。湿筛后土壤质量的回收率介于98.2％至100％之间，表明该方法的稳定性。SOM通过湿式氧化还原滴定法测定。
3 测序分析
不同团聚体粒径大小和处理组中的0.5g样品，通过使用Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, CA, USA)试剂盒进行提取DNA. 使用515F/909R and ITS3-2024F/ITS4-2409R)引物分别对原核的16S rRNA 和真菌内部转录间隔进行扩增。将唯一的样品识别条形码添加到用于PCR扩增的正向引物中，并进行三次PCR扩增并合并到每个样品中。PCR产物用Qiagen凝胶提取试剂盒进一步纯化。然后利用Illumina HiSeq2500平台对原核生物16S rRNA和真菌ITS基因进行高通量测序，得到250 bp双端序列。使用UPARSE算法将得到的高质量序列以97%的相似性聚成操作分类单元(OTUs)并且选取每个OTU中最丰富的序列作为其代表序列。此外，利用RDP分类器对单个otu的代表性序列进行分类。为了比较样本之间的相对差异，对每个样本中随机选择的原核生物和真菌的32,336和88,620序列进行下游分析。
4 共现网络分析
使用MINE软件中的极大信息系数(MIC)，将原核生物和真菌群落高通量测序数据进行共现网络分析。为了减少两两比较，降低网络复杂度，本文只选择相对丰度为> 0.05%的OTUs进行网络分析。在MINE中进行成对比较后，在Cytoscape v.3.6.1中选择了前300个交互来进行网络构建。网络图中显示了具有强正关系相关（r> 0.8），强负相关（r <-0.8）或强非线性关系（MIC- ρ2 > 0.8）的最重要的相互作用。选取前10,000个交互作用来评估网络的模块化和强线性关系。使用MINE软件评估了不同大小的聚集物中SOM含量与每种微生物OTU之间的关联。由于在不同大小的聚合体中OTU与SOM含量之间的关系弱得多，因此r> 0.7，r <-0.7或MIC-ρ2> 0.7的OTU被用于Cytoscape v.3.6.1中的网络构建。Cytoscape中的NetworkAnalyzer和CentiScaPe工具用于计算网络拓扑参数。使用具有较高平均度，较高紧密中心性和较低中间性中心的OTU共同用于识别梯形分类群。
5 统计分析
使用SPSS20.0对所有不同处理中不同粒径的团聚体中SOM含量和微生物进行方差分析（ANOVA）。采用配对样本t检验，研究了肥料类型和团聚体大小对主要原核真菌目相对丰度的影响。在测试差异之前，检查所有数据的方差的正态性和同质性（Levene检验），并在必要时进行ln转换以满足ANOVA分析的要求。此外，利用Pearson相关系数检验SOM含量与原核菌目和真菌学目之间的相关性。
利用R中的 monoMDS和 Adonis函数分别进行NMDS和双向ANOVA分析。
使用Metagenomic Profiles统计分析软件进一步分析原核或真菌OTU的相对丰度（> 0.05％），并且采用White的非参数t检验比较NPK和NPK+猪粪堆肥处理的原核或真菌OTUs的相对丰度。利用Cytoscape软件显示显著富集的OTUs。
结果
1 土壤性质
与NPK相比，NPK+猪粪土壤pH和AP较高，但NPK处理组与添加植物残体处理组中的土壤相似（表1）。在NPK+猪粪土壤中，TN（0.85g N kg-1）和SOM（8.21gckg-1）含量最高。猪粪的施用也使大型宏观团聚体（大于2000μm）所占比例由NPK的8.20%提高到30.6%，高于植物残体的处理。
不同粒径团聚体的SOM含量差异很大，分别为6.45-9.54和6.60-8.61 g C kg-1在>2000μm和250-2000μm团聚体中，其含量高于53-250μm和<53μm的团聚体（图1）。与NPK处理相比，植物残体处理组对所有粒径的SOM含量无影响（250-2000μm级除外）。相反的是，猪粪肥料的施用增加了各团聚体的SOM含量，特别是大团聚体中SOM含量。
图1 无机和有机施肥对团聚体粒度级SOM含量的影响。竖条表示均值的标准误差(SEM;n = 3)。不同字母表示同一团聚体大小等级的处理之间存在显著差异(p < 0.05)。
2 有机肥对微生物群落结构的影响
经过质量筛选，获得了原核生物和真菌的332,750和8,535,792个高质量序列，每个样本至少有32,336和88,620个序列。猪粪大幅度改变了原核和真菌的群落，形成了一个独特的群体，并且这个群体不同于其他处理，无论团聚体粒径的大小（图2）。与NPK处理组相比，添加植物残体处理组（NPK + PeanStraw, NPK + RiceStraw, and NPK +RadResidue）对原核真菌群落的影响较弱。团聚体的大小也对原核生物和真菌群落有重要影响。
相似性分析（ANOSIM）确认，长期的有机施肥会影响所有团聚体大小的原核和真菌群落（表2），但小于53μm粒径类别的真菌群落受到的影响较小。
图2 非度量多维标度(NMDS)分析(A)原核生物和(B)真菌群落与OTUs的序列相似性为97%。
不同的颜色表示不同的处理，不同的符号表示不同的团聚体大小类别
表2 通过ANOSIM分析了长期有机施肥对原核和真菌群落结构的影响。ANOSIM，基于Bray-Curtis距离的相似性分析，该距离是从具有9999个排列的相对OTU丰度计算得出。所有影响均在p <0.001时显著（除<53μm聚集体中的真菌，p = 0.013）。
Nitrososphaerales是所有不同粒径团聚体中的主要原核生物，但猪粪添加会降低其丰度（相对丰度）（图3A）。猪粪改良剂还降低了Thermogemmatisporales的丰富度，但增加了所有不同粒径团聚体的Bacillales和Gaiellales的丰富度。施用猪粪肥会大大增加> 53μm团聚体中的Pezizales的丰度，对于NPK和NPK +植物残渣，其含量分别从0.10％-0.69％，增至28-44％，而对于<53μm团聚体，增幅仅为0.15％至2.9％(图3B)。植物残体的施用增加了Sordariales的丰度(表3).Solibacterales和Mortierellales主要集中存在于< 53 μm 团聚体中（图4）。Rhizobiales的丰度随着团聚体粒径的增大而增加，而Eurotiales则呈现相反的趋势。
图3 长期施用无机肥和有机肥后在不同粒径团聚体中（A）原核生物和（B）真菌群落主要种群的相对丰富度。
表3 配对样本t检验肥料类型和团聚体大小对原核真菌目相对丰度的影响。↑和↓分别表示上升和下降(p < 0.05)，与平均丰度相比，↑和↓分别表示极显著的上升和下降(p < 0.01)。
图4 土壤团聚体对主要原核生物和真菌有显著影响。框的边界表示第一个四分位数和第三个四分位数，框内的线和方块分别表示中位数和平均值。触须表示第个10百分位和第个90百分位，离群值显示为点。不同的字母表示不同粒径团聚体之间的显著差异。
3 不同大小的团聚体中的原核和真菌共生模式
土壤团聚体大小影响原核生物群落和真菌群落的共生模式（图5）。微聚集体中微生物群落之间的负线性关系和正线性相关性数量大于大型聚集体。与大团聚体相比，微团聚体中正相关的增加主要发生在原核生物和真菌中，而负相关的增加主要发生在原核中（表4）。相比之下，非线性相关性在宏观聚集体中比在微观聚集体中要大得多。
图5 网络分析显示(A)大团聚体和(B)微团聚体在五种施肥处理下的原核与真菌共现和模式。每个网络选择前300个交互。红色线表示显著正相关(r > 0.8)线性关系,蓝线代表显著负相关(r < −0.8)线性关系,和重要的非线性(MIC -ρ2 > 0.8)关系是由绿线表示。
表4 网络分析中不同粒径团聚体中的线性相关的数量。每个网络分析中选择前10,000个交互关系。显著正线性相关 (r > 0.8)和显著负线性相关(r < - 0.8)。
4 微生物与有机质含量的关系
网络分析表明，SOM含量与37个OTUs存在较强的相关性在大团聚体中，仅与4个OTUs存在相关性在微团聚体中（图6）。皮尔逊相关分析表明，Bacillales，Gaiellales和Pezizales的丰度与SOM含量呈正相关，而与Acidobacteriales的丰度与SOM含量呈负相关，主要集中在大团聚体中（表5）。其中最具影响力的类群(Thermogemmatisporales)与大、微团聚体中SOM含量呈显著负相关（p < 0.001）。
图6 网络分析显示原核生物或真菌与SOM含量同时存在于(A)大团聚体和(B)微团聚体中。每个网络选择了前300个交互关系，只显示了显著关系。粉色和蓝色线表示显著正相关(r > 0.7)和负线性关系(r <− 0.7)，以及重要的非线性关系(MIC -ρ2 > 0.7)是由绿线表示。
表5 主要原核和真菌目与不同团聚体大小中SOM含量的Pearson相关分析。↑和↓分别表示在不同粒径聚合物与SOM的正相关和负相关（p <0.05），而↑和↓分别表示在不同粒径聚合物与SOM的相关性（p <0.01）。
讨论
1 猪粪的施用通过增强聚集作用来增加SOM
有机肥和团聚体大小对有机质含量影响的相互作用，表明有机肥可能通过调节土壤团聚对有机质含量产生影响。的确，与NPK相比，猪粪的施用同时增加了大团聚体的所占质量比例和SOM含量（图1，表1）。由于“相对大”的孔隙中SOM的积累，而造成小孔隙（<4μm）的比例增加，这种高聚集水平降低了有机化合物与微生物和细胞外酶的接触。添加葡萄糖后，β-葡萄糖苷酶的活性随团聚体的尺寸的增加而降低。大团聚体中参与不稳定SOM降解的酶活性也较低，从而减缓矿化，有利于SOM的积累。因此，在NPK+PigManure处理组中聚合能力的提高是增加有机质含量的重要因素。有机质含量的增加反过来又促进了团聚体的形成，因为有机质是土壤颗粒的重要结合剂，因此肥料的添加可能通过有机结合剂粘接小团聚体而增加大团聚体。
2 有机肥和团聚体对微生物群落的影响
团聚体的大小对土壤原核和真菌群落结构有较大影响（图2）。由于物理化学性质的异质性，微生物在团聚体大小上的分布模式也存在不同。大团聚体通常含有较不稳定的底物，而微团聚体中SOM的含量较高。而有机肥的类型对微生物群落结构的调节作用大于团聚体大小对微生物的调节作用，与大多数长期施肥研究一致。有机肥通过改变养分水平，特别是土壤C和N的含量来影响微生物群落，以及团聚体的聚合程度。微生物群落通常比生态位的大小更受资源可用性的限制，而猪粪的添加则大大增加了养分的有效性。因此，施用猪粪对原核生物和真菌群落的影响最大，因为猪粪对土壤的性质有很大的影响。有机肥料大程度改变了所有粒径团聚体中原核生物组成，而对<53μm的团聚体中真菌群落结构影响较小（表2）。这可能是因为（1）管理实践对微生物群落结构的影响随着团聚体尺寸的减小而降低，并且在<53μm聚集体中尤其低，（2）真菌群落比细菌群落更能抵抗环境变化，（3）细菌的多样性远远高于真菌，因此原核生物群落有更广泛的适应选择。
NPK处理组与不施肥处理的微生物群落结构相似。因此，施用NPK + PigManure后，所有聚集体中的Bacillales, Gaiellales和Pezizales的丰度都较高，这是由于猪粪肥料的刺激作用大于NPK的抑制作用。在石灰性流湿土壤中，施用有机肥可使Bacillales富集，对提高作物产量和土壤肥力起着关键作用，特别是加速土壤C和磷的循环。Gaiellales只有一个已知的物种(Gaiella occulta)，优先生长在pH值为6.5-7.5的范围内。这些物种的丰度随着土壤pH值从3增加到7而增加。因此，与NPK相比，NPK + PigManure处理中Gaiellales的丰度增加可能是由于土壤pH值升高所致。猪粪的施入，主要增加了> 53μm的团聚体中Pezizales的丰度，这表明Pezizales倾向于居住相对较大的团聚体中。Pezizales更喜欢具有可用有机化合物的栖息地，这些有机化合物在大团聚体中特别多，并可受到堆肥添加的进一步刺激。与NPK相比，植物残体的施用大大增加了Sordariales的丰度（表3）。在耕地中，秸秆残渣分解的早期阶段，发现Sordariales的成员占主导地位。这些结果表明，Sordariales可能在残渣降解和/或生活在有机残留物上发挥重要作用。
随着团聚体尺寸的增大，Rhizobiales的丰度增大，说明Rhizobiales更倾向于栖息在较大的团聚体中。Rhizobiale含有许多固氮菌和甲烷菌，与植物生长有关。因此，种植花生有利于Rhizobiale在较大的团聚体中生长，因为随着团聚体粒径的减小，微生物受植物根的影响较小。相反的是，随着团聚体粒径的增大，Eurotiales的丰度下降，Solibacterales和Mortierellales在< 53 μm团聚体中尤为丰富（图4）。相似地，Liao et al. 也报道了Mortierellales在< 53 μm团聚体中非常丰富。Eurotiales和Mortierellales的成员通常是腐生菌，而Solibacterales是寡营养的，并且它们都具有很强的降解顽固性物质的能力。
3 土壤团聚体对微生物共生模式的影响
微生物共生模式是评价微生物群落功能的重要工具，它可以揭示微生物之间潜在的相互作用，揭示土壤生态位结构。宏观和微观团聚体的网络拓扑结构不同（图5），后者具有更强的正负线性关系。这说明微生物之间的协同和拮抗作用在微团聚体中增强。如上所述，较不稳定的SOM以大团聚体形式积累，而顽固性的SOM则富含在微团聚体中。这些结果表明，不稳定SOM的缺乏加剧了微生物之间的竞争，而大量的不稳定SOM需要微生物的合作才能在微团聚体中降解。Ma et al.表明不利的土壤环境(强酸性、低养分/底物利用率)会加剧微生物群落之间的竞争与合作。然而，非随机的微生物联系可能更好地代表具有不同或相似生态位的物种，而不是生物间的相互作用。无论如何，当物种在不同的环境中共存时，生物间的相互作用可能会发生。秸秆或营养物质的添加可以减轻微生物的竞争，减少Red Chromosol的负相关数量，并且与块状土壤相比，小麦根际和花生根际的负相关和正相关比例分别有所降低和提高。这些现象可能是由于根际土壤中根系分泌物和植物残体的有机化合物比块状土壤中的SOM更不稳定和难降解，这减轻了竞争并增加了微生物之间的合作。因此，微团聚体中存在较多的正、负的微生物链结，可能表明微生物之间的竞争与合作由于条件不太有利而加剧，即更多顽固性SOM和较少的不稳定SOM。
4 生物与有机质含量之间的潜在联系
结论
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