科研 | Cell Host & Microbe：人类肠道细菌对食品加工过程中常见产物的降解
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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如今，加工食品和“超加工”食品的消费量急剧增加，然而这种加工食品往往与一些疾病风险相关。美拉德反应产物（如今，加工食品和“超加工”食品的消费量急剧增加，然而这种加工食品往往与一些疾病风险相关。美拉德反应产物（MRP）是在食品加工的加热过程中，由氨基酸和还原糖之间的非酶促反应形成的，会对健康产生影响。在大多数情况下，食品加工过程中形成美拉德反应产物会对肠道菌群的功能表达特性产生影响，反过来，肠道菌群也可以利用这些产物并代谢。本研究基于小鼠模型，利用分子生物学、生物信息学等手段研究一种常见的美拉德反应产物（MRP）——果糖赖氨酸（FL）对人类肠道细菌的影响，及人类肠道细菌对FL的利用和代谢途径。
论文ID
原名：Bioremediation of a Common Product of Food Processing by a Human Gut Bacterium
译名：人类肠道细菌对食品加工过程中常见产物的降解
期刊：Cell Host & Microbe
IF：15.753
发表时间：2019.10
通讯作者：Jeffrey I. Gordon
通讯作者单位：美国华盛顿大学医学院
DOI: doi.org/10.1016/j.chom.2019.09.001
实验设计
结果
1 乳清饮食对肠道中Collinsella菌属适应性的不同影响
图1.乳清蛋白饮食条件下对Collinsellaintestinalis DSM 13280和Collinsella aerofaciens ATCC 25986适应性的不同影响。（A）实验设计的概要图。小鼠（每组n=6）被接种包含92种细菌的菌群后，被单一饲喂10%含量的乳清蛋白或10%含量（与乳清蛋白含量相当）的氨基酸（AA）。无菌小鼠接受相同的饮食处理。在标注的饲养天数收集粪便样品，菌落的绝对丰度通过COPRO-seq来确定。（B和C）按照上述饮食饲喂小鼠的粪便微生物中Collinsella intestinalis（B）和Collinsella aerofaciens （C）的绝对丰度（平均值±SD）。数值参照添加标准品和粪便样品重量进行标准化。（D）根据从盲肠内容物中产生的微生物RNA-seq数据进行DESeq2检测分析，将乳清饮食条件下C.intestinalis基因表达的log10（倍数差异）与AA饮食条件下进行相比，就差异的统计学显著性作图（- log10（调整后p值））。与“果糖赖氨酸/葡萄糖赖氨酸代谢”相关的基因在mcSEED代谢模型中被标注为蓝色。不是果糖赖氨酸/葡萄糖赖氨酸代谢模型中的基因（P<0.05）用红色标注。（E）热图描绘了在C. intestinalis基因中确定的果糖赖氨酸/葡萄糖赖氨酸代谢位点的转录和主要表达情况。每个纵列代表一个独立小鼠。（F）C. intestinalis基因位点中预测与果糖赖氨酸/葡萄糖赖氨酸利用和代谢相关的基因。与饮食变化相关的基因表达已经标明。基因以它们自身的位点ID（COINT-XXXXXX）为标注，根据主要提供的颜色注释基因功能。（G）已知的细菌内果糖赖氨酸代谢途径，其通过一个6-磷酸-果糖赖氨酸中间体产生6-磷酸葡萄糖和赖氨酸。E. coli内利用果糖赖氨酸激酶而Salmonella利用PTS功能。（H和I）乳清或AA饮食条件下从接种后小鼠和无菌小鼠中获得的盲肠内容物（H）和血清（I），通过LC-QQQ-MS定量检测其中果糖赖氨酸的水平。（J）利用气相色谱-质谱（GC-MS）检测接种后小鼠或无菌小鼠的盲肠内赖氨酸水平。在图（H）（I）（J）中，一个点代表一只独立小鼠（根据饮食处理不同标注不同颜色），横线表示平均值。p<0.05（2-tailed Welch’s检验）。
通过粪便样品中的菌群DNA测序后进行群落概况分析（COPRO-测序），使研究者能够在菌株水平的分辨率下量化群落的组成。在DNA提取之前，通过添加已定量的两种细菌物种的细胞来确定每种菌株的绝对丰度，而添加的细菌并不属于要测序的菌群。结果表明，在成功定殖肠道的54种菌株中，与饲喂AA饮食的小鼠相比，食用乳清的小鼠肠道中有4种菌株的绝对丰度表现出明显不同（广义线性混合效应泊松模型，调整后的p值<0.05和|估计|>1）。其中两个受到影响的菌株属于Collinsella菌属；在饮食转变后的第7、14和21天时，与AA饮食的小鼠相比，乳清饮食的小鼠肠道菌群Collinsella intestinalis DSM 13280的绝对丰度平均提高3.4倍（图1B）（p<0.00001，根据多重比较后渐进式Wald检验进行了调整；每个处理组中n=6只小鼠），然而Collinsella aerofaciensATCC 25986菌属的丰度降低了超过10倍（p<0.0001）（图1C）。通过对十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠内容物的COPRO测序分析，证明由乳清饮食引起的C. intestinalisd显著增加和C.aerofaciens的显著减少现象都是显著的。Bacteroides thetaiotaomicron 7330和Escherichia fergusonii ATCC 35469在乳清饮食下也表现出绝对丰度的增加；然而，这些菌种在饲喂后第21天的丰度平均比C.intestinalisd的丰度低3到6倍。因此，研究者选择关注系统发育比较相似Collinsella菌属的不同响应。
2 C. intestinalisd中参与果糖赖氨酸（FL）摄入和代谢相关基因的上调
为了确定观察到的Collinsella菌属丰度变化的机制，研究者首先从单饲喂乳清或AA饮食3周的小鼠中收集盲肠内容物，并进行微生物的RNA测序（RNA-seq）。对于Collinsella intestinalisDSM 13280菌株，两种饮食处理之间有73个基因的表达差异具有统计学意义（图1D，DESeq2调整后p<0.05）。利用微生物群落SEED（mcSEED），该SEED平台已被用于精细手动注释来自大约2600个人类肠道细菌基因组中的特定子系统，研究者发现“FL和葡萄糖赖氨酸的利用”是C. intestinalisd内mcSEED代谢模块中最显著上调的部分（调整后p值<10-11；基因组富集分析；图1D）。该途径中上调的基因主要位于单个基因组位点，其编码一个预测的FL/葡萄糖赖氨酸磷酸转移酶系统（PTS）、FL-6-磷酸/葡萄糖赖氨酸-6-磷酸脱糖酶和GntR家族转录因子的组分。总而言之，在该FL/葡萄糖赖氨酸利用的基因座中，C. intestinalis内前16个基因中有9个基因在乳清饮食条件下展现出表达增加的情况（图1E和图1F）。因此，在乳清饮食环境中，C. intestinalis菌株中假定的用于FL摄取、磷酸化的PTS机制及产生6-磷酸葡萄糖和赖氨酸所需的FL-6-磷酸脱糖酶都出现了上调（图1G）。C. aerofaciens ATCC 25986在乳清饮食中的绝对丰度降低，且包含一个预测的PTS机制和用于FL摄入和降解的脱糖酶；同时这些基因的一部分但不是全部在乳清饮食条件下出现表达量增加的现象。
对已确定群体中的54个成员注释基因组进行检查，研究者预测有三个成员（Collinsellaplus Clostridium bolteae，Citrobacter youngae和 Fusobacterium varium）可能通过PTS系统来利用FL，而另外四个菌株（Escherichia coli，Clostridium asparagiforme，Clostridium symbiosum和Tyzzerella nexili）则利用FL特异性通透酶和FL激酶。在这些生物中，只有C. intestinalis和C. aerofaciens的绝对丰度在两种饮食条件下展现出统计学上的显著差异。但是，除了C. intestinalis，C. aerofaciens和F. varium外，这些生物的丰度在两种饮食环境下都很低。暴露在乳清条件下F.varium的丰度尽管出现了增加，但其丰度增加的程度在统计学上没有意义。总的来说，这些发现提出了一个问题，即尽管预测中具有相似的代谢能力，为什么只有C. intestinalis和C. aerofaciens这两株菌对乳清饮食条件具有相反的适应性响应。
3 以乳清为食的定殖小鼠肠道中果糖赖氨酸（FL）和赖氨酸含量升高
研究者假设FL相关基因的上调可以通过乳清饮食条件下FL的增长从而帮助观察到C. intestinalis绝对丰度的增加。先前的研究已经确定，把牛奶加工成乳清的过程中，葡萄糖和赖氨酸会形成FL（涉及到加热的过程）。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，研究者确认了本实验中的乳清蛋白分离物中存在己糖修饰的赖氨酸。鉴于牛奶中不含果糖（葡萄糖赖氨酸的前体），研究者将质谱结果解释为乳清制剂中含有FL和/或塔格糖赖氨酸（分别由葡萄糖和半乳糖产生）。因为微生物的塔格糖赖氨酸代谢并没有特点，因此研究者比较关注FL。
为了确定乳清中存在的FL是否会影响本实验中无菌小鼠的盲肠营养环境，研究者开发了一种液相色谱三重四级杆质谱方法（LC-QQQ-MS）来定量盲肠内容物和血清中的FL。与AA饮食相比，以乳清为食的情况下，移植了已知菌群的小鼠和无菌对照小鼠的盲肠内容物中都表现出FL的显著增加（p<0.0001，2-tailed Welch’s t检验）（图1H）。血清水平上却没有表现出明显差异，这表明在小鼠肠道中FL不容易被吸收（图1I），这个结果与之前在大鼠和人类中观察到的结果一致。
研究者还使用了靶向质谱分析法来定量移植小鼠和无菌小鼠盲肠内容物中16种氨基酸的含量以及20种单糖、二糖和糖醇d 含量与饮食之间的关系。在移植菌群后的小鼠中，与AA饮食相比，赖氨酸是唯一一个在乳清饮食条件下水平显著升高的氨基酸（调整后p值=0.026，Mann-Whitney U检验）（图1J）。在计算机上进行的代谢重建结果表明，C.intestinalis DSM 13280是一个预测的赖氨酸营养缺陷型菌株，而C. aerofaciens是一个预测的原始营养型菌株。饮食对移植小鼠盲肠中20种碳水化合物中任何一种的水平均无影响；与移植的小鼠相比，无菌小鼠中有16种碳水化合物出现了显著增加，这表明它们是特定菌群成员的碳源。
4 Collinsella的两个物种都可以在体外分解代谢FL
为了比较当FL为主要碳源时Collinsella菌株的体外生长情况，研究者用N-α-叔丁氧羰基-L-赖氨酸和D-葡萄糖合成了克量的ϵ-FL，并研发了一种培养基，在这种培养基条件下Collinsella的产量取决于碳源的添加。在没有补充碳源的情况下，基础Collinsella培养基（BCM）不支持OD600=0.25以上的C.intestinalis或C. aerofaciens菌株的生长。
当5~20mM FL添加到BCM培养基时，两种Collinsella菌株的最大OD600均上升（图2A和2B）。菌群成员之一B. thetaiotaomicron VPI-5482并不编码FL降解酶，其可以作为实验的对照组，在添加FL后并不会提高其最大OD600。有趣的是，对于乳清条件下在小鼠体内生长旺盛的C.intestinalis DSM 13280，与葡萄糖作为碳源添加到BCM培养基中相比，其生长速率在FL为唯一碳源时显著提高（p<0.05；2-tailed Welch’s t检验）（图2A）；相反，对于C.aerofaciens的体外生长，在乳清饮食条件下小鼠体内的丰度反而下降了（图2B）。从C.intestinalis和C. aerofaciens稳定生长时期单培养物中收集用过的培养基，检测其FL含量小于无菌条件下对照培养基中FL含量的5%（图2C）。相反，B. thetaiotaomicron VPI-5482（预计其并不利用FL）对培养基中FL的浓度没有显著影响（图2C）。研究者得出的结论是，Collinsella的两种菌株可以在体外培养条件下代谢FL。鉴于C. intestinalis菌种在FL为碳源比葡萄糖为碳源的条件下拥有更快的生长能力，研究者检测了以下假设：C. intestinalis在体内的优势优于C.aerofaciens，这可能与它们利用FL衍生代谢物之间的差异及它们对FL利用位点的调节差异有关。
图2.CollinsellaintestinalisDSM 13280菌和Collinsella aerofaciens ATCC 25986菌在体外可以代谢果糖赖氨酸。（A和B）C. intestinalis（A）和C.aerofaciens（B）在根据所示浓度补充了赖氨酸、葡萄糖和果糖赖氨酸的BCM培养基上随时间的生长曲线。灰色代表标准差（每个处理3个生物学重复）。（C）标注的菌株在包含20mM果糖赖氨酸的BCM培养基上达到稳定生长期后，从对应的培养基中检测果糖赖氨酸的量（对数尺度）。所有值都经过未接种培养基（包含20mM果糖赖氨酸的BCM培养基；BCM+FL（无细菌））的标准化处理。不含果糖赖氨酸的BCM培养基结果也展示在图中（“BCM（无细菌）”）。B. thetaiotaomicron VPI-5482不包括果糖赖氨酸/葡萄糖赖氨酸的利用位点，作为阴性对照。每一点表示一次单独培养。横线表示平均值。p<0.05（2-tailed Welch’s检验）。
5 同位素示踪法确定果糖赖氨酸（FL）的代谢途径
为了确定C. intestinalis是否可以从FL的下游代谢差异中获得其在体内生长的优势，研究者使用同位素来追踪确定这两种菌株单培养物ϵ-FL的途径。研究者使用了两个普遍的标记：ϵ-[U-13C,U-15N]FL([U]FL)以及ϵ-果糖 [U-13C,U-15N]赖氨酸(F[U]L)（标记在赖氨酸部分）。这个方法使研究者能够确定代谢产物是来自葡萄糖还是赖氨酸部分。在补充了FL、[U]FL、F[U]L的BCMyeast（BCMy）培养基中生长至对数中期后，通过过滤将细菌细胞从培养基中分离出来，同时用质谱法检测各种细胞内和细胞外的代谢产物。图3A中的代谢途径总结了研究者在[U]FL培养基上生长期间分析物及其主要同位素的量。
图3. Collinsellaintestinalis DSM 13280和Collinsella aerofaciens ATCC 25986中果糖赖氨酸的代谢途径。细菌在缺氧条件下在包含以下碳源的BCM培养基上生长；碳源标志为，glu：[13C]glucose；FL：ϵ-fructoselysine; [U]FL：ϵ-[U-13C,U-15N]fructoselysine；F[U]L：ϵ-fructose [U-13C,U-15N]lysine。（A）在BCMy+[U]FL培养基上将C. intestinalis和C. aerofaciens培养至对数中期时通过质谱检测代谢物的示意图。细胞内或培养基代谢物的检测结果都展示在图中。图中描述了中心碳代谢过程每一个中间体或产物检测到的标记和未标记的碳原子或氮原子。例如，[U-13C,U-15N] fructoselysine用14个圈表示，其中12个代表碳-13（红色），2个代表氮-15（黄色）。如果检测给定代谢物中拥有多个同位素，则显示两个同位素（例如检测到丙酮中既有3个碳原子-13（红色），又有3个未标记的碳原子（黑色））。虚线表示未展示所有的酶促步骤。（B）当图中物种在BCMy单培养基条件下生长至对数中期时，从培养基中回收的每一种果糖赖氨酸同位素的量。碳源的起始浓度为20mM。每一个点代表一次独立培养。（C~E）C. intestinalis在[U]FL（i）、F[U]L（ii）和FL（iii）培养基上及C. aerofaciens在[U]FL（iv）、F[U]L（v）和FL（vi）培养基上分别生长至对数中期时，对收集回来的培养基分别检测赖氨酸（C）、甲酸盐（D）和乙酸盐（E）的浓度。“对照”指同一时期对应的菌株在含相同碳源的无菌培养基BCMy上的情况。（F~G）对于C. intestinalis和C. aerofaciens在图（C）（D）（E）中得到的每种代谢物，根据代谢物（灰色，M[未标记的量]；红色，M+3[存在的3个碳原子-13]；蓝色，M+6[存在的6个碳原子-13]）总量检测每种同位素的百分比。
对于这两个菌种，研究者观察到每种被测同位素存在条件下FL的胞外水平降低（图3B）。通过[U]FL或(F[U]L中两个菌种的生长，研究者发现被完全标记的[U-13C,U-15N] 赖氨酸（FL-6-磷酸脱糖酶的产物）的摩尔浓度增加（图3Ci、3Cii、3Civ和3Cv）。这一发现表明，至少在本实验中赖氨酸充足的培养基中，来源于FL的赖氨酸通常会分泌到细胞外。这两个菌种都产生高水平的甲酸盐和乙酸盐；这些代谢产物来源于6-磷酸葡萄糖，而不是赖氨酸，因为菌株在[U]FL培养基生长期间可检测到[13C]甲酸酯和[13C]乙酸酯（图3D的i、ii、iv和v及图3E）。这个结果表明C. intestinalis和C. aerofaciens利用厌氧途径，其中涉及到丙酮酸甲酸酯裂解酶（EC2.3.1.54）将丙酮酸转化为甲酸酯和乙酰辅酶A（可产生乙酸盐）。除了从[U]FL培养基中生成的乙酸盐和甲酸盐外，研究者还鉴定了未标记的乙酸盐和甲酸盐，其可能来源于BCMy培养基中存在的其他碳源，例如酵母提取物。
研究者在D-[13C]葡萄糖（glu）、[U]FL和F[U]L培养基中培养细菌，以鉴定FL代谢下游的中间体。对于Collinsella的两种菌株，研究者发现完全标记的[13C]6-磷酸葡萄糖是[U]FL（和[13C]葡萄糖的对照）培养基中获得的独有同位素，证实了它是由FL产生的（图3Fi和图3Gi）。而细胞在(F[U]L培养基条件下生长时，并没有检测到胞内[13C]6-磷酸葡萄糖。研究者发现糖酵解中间体1,6-二磷酸果糖和3-磷酸甘油酯具有相似标记模式，且几乎完全检测到了[13C]葡萄糖和[U]FL培养基下完全标记的[13C]同位素异构体（图3Fii、图3Fiii、图3Gii和图3Giii）。研究者认定对于Collinsella的两种菌株，几乎所有通过糖酵解过程中的6-磷酸葡萄糖都来源于FL。检测到两个未标记和[13C3]同位素（M+3）标记（而不是[13C4]同位素标记）的三羧酸循环中间体富马酸酯和琥珀酸酯，可能是厌氧代谢的最终产物（图3Fvi、图3Fvii、图3Gvi和图3Gvii）。该结果表明，CO2掺入草酰乙酸的可能性最大，这可能是通过磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化酶（EC4.1.1.31）将PEP转化而来（该酶的同源物分别由C. intestinalis和C. aerofaciens 的COLINT_03003 和 COLAER_RS03775基因编码）（图3A）。对于糖酵解产物丙酮酸和乳酸，以及乙酸和甲酸，研究者在[13C]葡萄糖或[U]FL培养基条件下观察到未标记和完全标记的同系物（图3Fiv、图3Fv、图3Giv和图3Gv）；研究者假设此结果是由于培养基中的其他碳源引起的，但当仅在F[U]L培养基条件下，并未检测到标记的丙酮酸或乳酸（图3Fiv、图3Fv、图3Giv和图3Gv）。
总之，研究者得出的结论是，从FL衍生的6-磷酸葡萄糖是糖酵解的唯一碳源，且FL代谢导致赖氨酸、甲酸和乙酸被分泌至胞外。这些同位素标记研究并没有发现两个物种之间存在显著的代谢差异，从而去解释乳清饮食对其适应性的不同影响。
5 乳清饮食影响其它Collinsella菌株在无菌小鼠肠道内的定殖
研究者对另外10种人类肠道来源Collinsella菌株的基因组进行测序，以鉴定出可能解释C. intestinalis和C. aerofaciens两个菌株之间适应性差异的基因组特征。10个菌株中每一个都鉴定了FL/葡萄糖赖氨酸的利用机制。接着研究者将这10种菌株接种到无菌小鼠体内。小鼠首先被包含C.intestinalis DSM 13280 和 C. aerofaciens ATCC 25986.菌群定殖。饲喂一周后，将小鼠从基础饮食调整为10%AA或乳清饮食；一周后，这些小鼠再被接种另外10种Collinsella菌株（图4A）。对连续收集的粪便样品中DNA进行COPRO测序显示，在AA饮食条件下，10种菌株中的3种（两种C. intestinalis和一种C. aerofaciens）已经定殖在小鼠中，其绝对丰度类似于两个原始Collinsella菌株（请注意在接种另外10种菌株后，这些原始菌株的绝对丰度都出现了下降）（图4B）。在乳清饮食条件下，C.intestinalis DSM 13280仍占主导地位；而另外2种C. intestinalis菌株在定殖后的绝对丰度要降低8~19倍。
图4.多种C. intestinalis和C. aerofaciens菌株可以利用果糖赖氨酸。（A）实验的设计。无菌小鼠在第0天接种含92种菌的菌群（包括C. intestinalis DSM 13280 和C. aerofaciens ATCC 25986），并且单一饲喂含10%乳清蛋白饮食或含10%氨基酸（与乳清相当）的饮食。在第7天，一组小鼠饲喂包含10种另外Collinsella菌株的饮食；其它组小鼠不处理（每个处理组n=6）。（B）在标注天数时检测小鼠粪便微生物中每种Collinsella菌株的绝对丰度（平均值±SD）。另外6种Collinsella菌株并没有在相应天数的受体小鼠样品中检测到。成功定殖的菌株根据关键字进行颜色标记；存在于原始92种菌群中的两种菌用黑体突出显示。（C）每种菌株在包含相应碳源的BCM培养基上的最大生长速率（每小时OD600的表化）。（n=6且独立培养，平均值±SD）。p<0.05（2-tailed Welch’s检验）。（D）分析Collinsella菌株中含有果糖赖氨酸/葡萄糖赖氨酸代谢基因的基因组。具有相同功能注释的基因对应相同的颜色。FrlR1和FrlR2的候选结合位点用黑色圆圈表示。灰色阴影将编码蛋白基因中BLAST pE值<105与氨基酸同源性>50%的连接起来（深色阴影表示更高的同源性）。每个基因组的基因座标签在左侧展示，同时每个基因用其基因座编码代表。（E） 重组的FrlR1/FrlR2调节子中相同结合位点基序的序列标志。
研究者接下来检测了每一种定殖菌株在包含FL、葡萄糖或两种碳源都有的BCM培养基上体外培养的生长情况。当FL为主要碳源时所有的菌株都可以生长，这个现象与它们的基因组都包含FL利用和代谢相关基因的情况一致。体外培养的两种C.aerofaciens菌株在葡萄糖培养基上生长速度比FL的快（图4C）。在FL碳源培养基上四种C.intestinalis菌株中的三种都达到了最大生长速率（图4C）；唯一的例外是C.intestinalis LFYP_54，它是唯一一种与C. aerofaciens菌株具有相似表型的菌株（在葡萄糖培养基上生长速度比FL的快）（图4C），同时也是唯一一种C. intestinalis菌株在小鼠喂食AA时可以定殖而不是在乳清饮食条件下定殖（图4B）。在两种碳源（葡萄糖+FL）复合的培养基上菌株的最大生长速率与菌株的最适碳源条件下的最大生长速率基本相当（比如在葡萄糖上生长比较快的菌株，其在葡萄糖+FL培养基上生长速率相似，而在FL上生长比较迅速的菌株，在葡萄糖+FL培养基上也以相似的速率生长）（图4C）。
6 比较基因组学预测FL利用的调节子
鉴于观察到的菌株生长速率上的差异，研究者比较这些菌株的FL利用基因座。尽管所有菌株都包含FL利用基因的最小互补序列，但这些基因的基因组结构却发生了变化，且这些变化与生长速率表型相关。C. intestinalis LFYP_54的基因座结构与C. aerofaciens菌株具有同源性，其在四个PTS基因后存在一个脱糖酶基因（图4D）；拥有这种基因组结构的菌株在葡萄糖培养基上的生长速率比FL快（图4C）。另外三种C. intestinalis菌株拥有重新排列的FL基因座，其脱糖酶基因的位置在PTS系统基因的中间（图4D）；它们在FL培养基上生长速率快于葡萄糖（图4C）。这一发现使研究者假设该基因组的转录诱导或抑制可能根据其结构的变化而不同。
最具特色的FL利用基因座是B.subtilis和E. coli中的那些基因座，它们是由GntR家族转录因子FrlR调控的。GntR阻遏物通常是通过代谢效应物的变构结合而失活。对六种Collinsella菌株中每一个的基因组搜索显示，他们的FL利用基因座包含多个预测的GntR家族转录调节因子，且它们是成对出现的（FrlR1和FrlR2在图4D中所写为R1和R2）。它们和许多其它Firmicutes在这些基因座内或之外还具有成对或不成对的其它FrlR旁系同源物。B.subtilis的FrlR调节子被frl启动子抑制，其作为一种同源二聚体通过结合具有回文对称性的保守操纵基因基序来达到抑制效果；然而这个保守操纵基因基序在Collinsella菌株的任何一个FL基因座中都没有发现。利用比较基因组学的方法，研究者在Collinsella菌株FL利用基因的上游区域鉴定了一个18bp的DNA基序，但这个基序缺乏回文对称性（图4E）。预测出的大多数目标基因之间都有两个串联位点，其间隔为15~17bp，表明FrlR调节子会结合在DNA上（图4D）。同源二聚体B. subtilis的GntR调节子NagR进行X射线晶体学研究确定了三个关键残基，它们介导碱基的特异性结合（Arg38，Arg48和Gly69）从而调节涉及N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）利用相关基因的表达。这三个残基可能在Collinsella菌株中也存在介导结合，因为它们在研究者检测的所有Collinsella FrlR1调节子中均是保守的。而Arg48和Gly69在Collinsella FrlR2中是极其保守的。
7 Collinsella菌株在混合营养环境下表现出FL基因组不同程度的抑制
为了进一步研究可以解释其对体内乳清的不同适应性响应机制，研究者在包含葡萄糖、葡萄糖+赖氨酸、FL或葡萄糖+FL的BCM培养基上培养了C. aerofaciens ATCC 25986和C. intestinalis DSM 13280菌株。研究者在菌株生长指数期收集了样品并进行RNA提取，从而进行了微生物的RNA测序。与单一碳源的FL条件相比，在葡萄糖+赖氨酸培养基条件下每个菌株有超过200个基因出现差异表达，证明菌株对碳源的改变表现出强烈的响应。主成分分析（PCA）将来自FL和葡萄糖+FL培养基中的C.intestinalis转录组数据归类到PC1组合（图5A），但并没有对同源的C. aerofaciens转录组数据进行分组（图5B）。取而代之的是，葡萄糖+FL培养基中的C. aerofaciens转录组数据与葡萄糖培养基上的数据归为一类（图5B）。总的来说，这些发现表明，无论葡萄糖存在与否，C.intestinalis菌株的基因在响应FL碳源时发生了广泛的变化，而C. aerofaciens菌株在葡萄糖存在时会忽略FL进行基因表达。这种碳分解代谢物阻遏现象，即其中一种碳源抑制了次要碳源的转录响应现象在细菌中十分常见，但这种现象在Collinsella菌株中并没有相关描述。
图5. C. aerofaciens ATCC 25986和C. intestinalis DSM 13280菌株对复合碳源环境展现出相反的转录水平响应。(A和B）对C. intestinalis（A）和C. aerofaciens（B）在包含相应碳源（20mM葡萄糖、10mM葡萄糖+10mM赖氨酸、20mM果糖赖氨酸或10mM葡萄糖+10mM果糖赖氨酸）的BCM培养基上生长得到RNA测序数据的主成分分析。（C和D）与葡萄糖+赖氨酸培养条件相比，C. intestinalis（C）和C. aerofaciens（D）中具有果糖赖氨酸/葡萄糖赖氨酸注释的基因在果糖赖氨酸培养基上发生上调。数据是按碳源分组同时rlog已转换且居中。每列代表一个独立的单培养。右边的颜色条表示当图1.中小鼠在乳清饮食条件下与AA饮食相比每个基因的表达是否出现显著不同。
无论葡萄糖存在与否，C. intestinalis DSM 13280菌株的基因座拥有完整的PTS系统基因和2个FL-6-磷酸脱糖酶，其在FL存在的情况可以被诱导表达（图5C）。另外， GntR家族四个转录因子中的三个成员（展示在图4D中）可以与这些FL-脱糖酶基因共表达（图5C）。C. intestinalis菌株在FL单一碳源或葡萄糖+FL复合碳源两种培养基条件下并没有明显的差异调节基因。预测可以代谢FL且受FL诱导的C. aerofaciens菌株基因出现在多个基因座中：COLAER_RS08740-8780编码FL代谢途径中所有基因的同源物，包括一对FrlR1/R2调节子，一个FL的PTS和FL-6-磷酸脱糖酶；虽然第二个基因座（COLAER_RS1890 1935）的功能尚不清楚，但其可以编码FL激酶、FL-6-磷酸脱糖酶的同源物和其他几种并不清楚的酶和转运蛋白。与葡萄糖培养基相比，C. aerofaciens ATCC 25986菌株内两个基因座在FL存在时的表达出现明显增加，但在葡萄糖+FL条件下没有出现明显变化（图5D）。C.aerofaciens中FrlR1/R2的表达模式与观察到的FL代谢基因相同，其仅在FL存在的情况下增加表达水平（图5D）。而在图1所示的乳清饮食条件下小鼠的体内实验中，这些C. aerofaciens菌株的基因并不是普遍上调（图5D）。因此，C. intestinalis菌株中代表FL代谢的基因组并不会被葡萄糖抑制，而C. aerofaciens菌株中的两个基因座则被葡萄糖抑制。研究者猜想基因调节的差异可以解释两种饮食情况下在富含葡萄糖的小鼠肠道环境中C. intestinalis菌株具有适应性优势（如上所述，这些饮食中74%的卡路里来自蔗糖、麦芽糊精和玉米淀粉）。
8 FL足以增加C. intestinalis DSM 13280菌株在体内的丰度
研究者将ϵ-FL添加到小鼠的饮用水中（小鼠已经接种确定的菌群），同时单一饲喂AA饮食从而检测FL对于C.intestinalis DSM 13280菌株在体内的扩增是否足量。研究者最开始检测了三种不同浓度的FL，这是根据之前观察到的小鼠耗水量，每天为每只小鼠提供2.5、10和25mg的剂量。对照组小鼠的饮用水中溶解了赖氨酸，其摩尔浓度相当于每天10mg FL的量（赖氨酸每天4.7mg）。盲肠内FL浓度表现出FL添加剂量增加的依赖性（图6A；p=0.018，Spearman’s秩相关）。此外，补充FL后C. intestinalis DSM 13280菌株的绝对丰度增加；增加的幅度取决于剂量，最高剂量产生水平在第7天时比赖氨酸对照组高出9.5±4.0倍（平均值±SD；图6B；调整后p值<0.05，广义线性混合-效应泊松模型）。研究者还注意到在高剂量下血清中FL浓度有增加的趋势（25mg/d时FL浓度为125±43μM，而10mg/d时FL浓度为80±13μM；p=0.12；2-tailedWelch’s检验）。C. aerofaciens ATCC 25986菌株的丰度没有像在乳清条件下那样降低，但是在最高剂量FL的作用下，其绝对丰度在统计上有适当提高（图6C）。
图6.果糖赖氨酸含量足够C. intestinalis DSM 13280菌株在小鼠体内增殖。（A）通过LC-QQQ-MS定量盲肠内容物中果糖赖氨酸的水平。接种的小鼠每日定量喂食氨基酸饮食、乳清饮食或氨基酸加水（添加了赖氨酸（Lys）或果糖赖氨酸（FL））饮食。每个点代表相同处理组中每只独立的小鼠。横线表示平均值。（B和C）依据不同时间和处理，C. intestinalis（B）和C. aerofaciens（C）在粪便微生物组中的绝对丰度（平均值±SD）。饮食在第0天开始改变，同时赖氨酸（Lys）或果糖赖氨酸（FL）加入到饮用水中以达到相应的每日剂量。（D和E）热图描绘了根据每日果糖赖氨酸剂量C. intestinalis（D）和C. aerofaciens（E）中果糖赖氨酸应答基因的rlog转化和主要基因表达。
研究者通过重复的菌群定殖实验和无菌小鼠在高剂量FL条件下诱导实验，确定了C. intestinalis绝对丰度的增加属于FL依赖性。作者在FL条件下再次观察到C. intestinalis菌株显著且稳定地增加。而C. aerofaciens菌株在FL条件下的增加很显著但不持久。LC-QQQ-MS对盲肠内容物的检测证实，无菌小鼠体内FL的水平比被菌群定殖小鼠体内的高。研究者还观察到，与赖氨酸对照组相比，消耗FL的无菌小鼠体内FL呈升高趋势（p=0.11，2-tailed Welch’s检验；每组中n=4）。在消耗AA的无菌小鼠组中，研究者推测FL的形成是因为在无菌小鼠肠道中温度和pH条件下葡萄糖和赖氨酸的浓度较高。
最终，研究者进行了盲肠内容物的微生物RNA测序，以研究对FL补充的转录响应。通过对高剂量FL处理和最低剂量FL处理的菌群定殖小鼠进行比较，发现小鼠肠道中C.intestinalis DSM13280菌株FL代谢基因座中所有检测到的基因表达水平显著增加（比较图6D和图5C）。对于C. aerofaciensATCC 25986菌株，该响应更接近于模拟乳清饮食条件下的体内反应；它的主要FL利用操纵子（OLAER_RS008740-8780）被上调，而第二个基因簇（COLAER_RS01910-1925）被下调（图6E，请注意FrlR调节子与该基因簇无关）。
讨论
研究者已经确定了人类肠道微生物菌群成员是如何响应食品加工中引入的常见食品化学修饰物。利用这种蛋白修饰物作为碳源，C. intestinalis菌株在FL存在条件下适应性增强。这些发现是在含54种系统发育多样人类肠道来源细菌的小鼠中观察到的，同时这些菌株的基因组序列已知，且小鼠以乳清为唯一蛋白质来源。在该模型系统中，乳清中的FL部分是MRP的代表。MRPs是AA和还原糖之间的非酶促反应，它经常在烹饪或各种形式食品加工过程中产生，并被广泛用于改善食品的口感、香气和颜色。一些MRPs（比如AGE羧甲基赖氨酸）与糖尿病和心血管疾病有关，而其它MRPs（比如丙烯酰胺）存在于许多富含淀粉的热加工食品中，包括土豆片和马铃薯，其可能与癌症相关。鉴于加工食品消耗量的急剧增加，MRPs可能是导致多种“西方”疾病的原因。
研究者发现，在益生菌小鼠模型中包含FL的乳清蛋白大大提高了沿肠道分布C. intestinalis菌株的绝对丰度，同时又减少了另一种相关菌群C. aerofaciens的绝对丰度。单独FL条件下C.intestinalis菌株在小鼠体内的适应性增加，且其伴随着预测的FL摄取和代谢基因座位点的转录将FL转化为赖氨酸和6-磷酸葡萄糖。Collinsella的两种菌株都包含这种基因座，且都可以以FL为唯一碳源，产生相似的中间体和产物。因此，研究者认为这两种菌株在体内的适应性差异至少部分与它们的FL利用位点的差异转录调控有关，这一个假设得到了研究者体外微生物的RNA测序结果的支持。C.aerofaciens菌株中预测的FL利用位点受到葡萄糖的抑制，而C. intestinalis菌株不受影响，因此饲喂富含蔗糖的乳清饮食条件下小鼠提供了针对其选择适应性响应的机制。目前对于Collinsella菌株缺乏合适的遗传学操作工具，使研究者无法直接操纵基因座来检验该假设。
碳分解代谢阻遏是细菌中普遍存在的现象，但其在肠道适应性方面的作用尚未得到广泛研究。B. subtilis是厚壁菌门中的一员，其含有在革兰氏阳性生物中研究比较清晰的碳分解代谢物阻遏系统；该系统包括全局调节子CcpA以及PTS系统的组分。Collinsellaspp.中的碳分解代谢物阻遏以前并没有相关报道，且其在相关的放线菌门中并没有一个很好的介绍。该菌门相关代表性研究缺乏CcpA依赖碳分解代谢物阻遏系统的元素，但可能具有替代机制来维持最优碳源的利用。比如，在Bifidobacterium longum中乳糖的存在抑制了葡萄糖转运蛋白的表达。在Streptomyces coelicolor中葡萄糖依赖的碳分解代谢物阻遏独立于PTS功能的发生，且涉及到葡萄糖激酶和多个功能未知的调节因子。Collinsella spp.中在本研究中发现其包含编码葡萄糖激酶（COLINT-03074）的保守基因和一般PTS组分Ptsl/HPr（COLINT-02545/COLINT-02546），但是不包含CcpA。未来需要开发其遗传操作工具，从而可以确定在Collinsella菌中调节碳源代谢的分子机制。
研究者鉴定了一个假设的机制，即通过GntR家族转录调节因子调节的FL利用位点的局部控制机制。研究者假设成对的FrlR1和FrlR2调节子可能形成异二聚体，以识别保守的非对称的DNA基序（图4E）。FrlR1可能通过Arg38和Arg48残基与基序左臂中保守的GG二核苷酸相互作用，而FrlR2可能与富含AT的右臂相互作用。串联的FrlR结合位点可以使异构二聚体能够协同结合，从而增强阻遏作用。通过对6-磷酸-GlcNAc响应的NagR阻遏物的类比，在变构效应物（例如在6-磷酸FL）存在的情况下，FrlR1/FrlR2二聚体可能从DNA上解离。FrlR1/FrlR2与C. intestinalis菌株中预测DNA操纵子之间相互作用机制的体外表征需要进一步确认，并确定FL或其磷酸化产物是否是参与操纵子结合的关键物质。
FL代谢是许多定殖在人类肠道中细菌群所共有的特殊功能。在2660个人类肠道细菌基因组的参考序列中，有414个包含FL代谢途径。这个途径在厚壁菌门中最普遍，但在放线菌门、变形杆菌和梭菌中也有发现。尽管肠道细菌和相关的基因组编码类似通透酶转运蛋白和激酶，但预计大多数分析的菌株可以利用FL，通过PTS对FL进行摄取和磷酸化。鉴于许多物种都包含多种假定FL代谢酶，其在遗传可操作生物体中的活性进行表征可以对其功能进行更精确的定义。
随着对当前食品化学成分研究的迅速增加，这是一个利用食品化学成分驱动微生物菌群响应和该响应下的分子机制从而去鉴定生物活性成分的机会。无菌小鼠模型可以加快研究者对常见食物成分对肠道菌群影响的理解。这项工作可能包括表征当前以及未来食品加工方法的影响，并为与“食品安全”有关的人体研究提供了令人信服的理论依据和指导。例如，整合当前的研究结果可以得出一个可验证的设想：各类MRPs中加工食品的消耗量较高且消费者体内微生物群具有代谢加工食品的能力，共同影响它们引起不良生物效应的可能性。在本研究中描述的无菌小鼠模型可以用来检测这一假设，并具有潜力鉴定能够降解MRPs益生菌的候选目标，否则这些MRPs会引起宿主病理性异常。随着精细化加工食品和超精细加工食品的普及变得越来越普遍，高危人群可能会被考虑作为临床研究中阳性对照的候选者，在临床研究中患者接种候选者肠道菌群，而这些菌群可以修复患者饮食中由加工食品成分对身体造成的损伤。
评论
加工食品消耗量的日益增加已成必然，而伴随加工食品产生的美拉德反应产物（MRP）往往与许多疾病相关。本研究详细介绍了一种常见MRP（果糖赖氨酸）与人类肠道菌群之间的相互作用机制，为人类与食品安全的相关研究提供了理论依据。根据本研究的发现，有望在临床研究中治疗因加工食品成分对人体造成的损伤和相关疾病。
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