科研丨Cell子刊：母乳喂养方式影响母乳与婴儿肠道的共生细菌
编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。
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肠道菌群对婴儿健康起着至关重要的作用。目前公认母乳中含有内源性和外源性的活菌，但尚不清楚这些细菌是否会转移到婴儿的肠道，以及这一过程是否受到母乳喂养方式的影响。该文章显示某些细菌，包括Streptococcus spp. 和 Veillonella dispar，在母乳和婴儿的粪便中同时出现，并且当婴儿饮用储存的母乳时，同时出现的情况减少。共同物种的相对丰度在母乳和粪便之间呈正相关。总的来说，肠道菌群的组成与母乳喂养的专一性和持续时间密切相关，而与母乳喂养方式无关。此外，母乳中的细菌与婴儿微生物组的其他修饰因素(如出生方式)在很大程度上影响肠道微生物群的整体变化。这些结果为母乳可能将细菌转移到婴儿肠道并影响微生物群的发育提供证据。
论文ID
原名：Breastmilk Feeding Practices Are Associated with the Co-Occurrence of Bacteria in Mothers Milk and the Infant Gut: the CHILD Cohort Study
译名：母乳喂养方式与母乳和婴儿肠道细菌的共生有关:儿童队列研究
期刊：Cell Host & Microbe
IF：15.923
发表时间：2020.07
通讯作者：Meghan B. Azad
作者单位：加拿大温尼伯曼尼托巴大学儿科学与儿童健康系
实验设计
首先使用冗余分析(RDA)评估母乳喂养方式和肠道菌群组成之间的关系。检测母乳喂养方式与婴儿肠道中不同细菌的富集和相对丰度之间的关系。评估个体间ASV的共享情况，进一步评估母乳中共同细菌的相对富集度与母婴对中婴儿内肠道菌群的相关性，接下来，评估母乳喂养的方式是否与母婴对中乳-肠细菌共享的程度有关，然后我们关注最常见的ASVs，并评估母乳喂养方式和专一性对婴儿肠道和3个月时母乳中菌群的富集和相对丰度的影响潜力。在单因素分析中，进一步评估母乳喂养的持续时间是否影响婴儿肠道在1年时共同共有的细菌。最后使用RDA评估母乳中共享菌和未共享菌的相对丰度，作为母乳喂养婴儿肠道微生物群组成可能变异的来源。
结果
1 婴儿肠道微生物群的组成、多样性和成熟度与母乳喂养的专一性和持续时间有关，但与偶尔喂存储母乳无关
首先使用冗余分析(RDA)评估母乳喂养方式和肠道菌群组成之间的关系(图1A-1C)。在3个月时，在双单变量分析中，与完全或部分母乳喂养的婴儿相比，不再母乳喂养的婴儿微生物群组成有所不同(图1A)。在部分母乳喂养的婴儿和纯母乳喂养的婴儿之间观察到细微的差异。母乳喂养婴儿中，在单因素模型(图1B)和调整后模型中，母乳喂养方式与肠道菌群组成无关，也与肠道菌群总体多样性(p=0.093，图1E)和菌群成熟度(p=0.55，图1E)无关。1年后，在单变量模型和校正模型中，母乳喂养时间解释了观察到的婴儿肠道微生物群组成变化的1.01% (p = 0.001)(图1C;表S3)。与调整后的模型中有年长的兄弟姐妹所解释的差异具有可比性。还观察到母乳喂养方式对肠道菌群多样性和成熟度的影响(图1D和图1F)。在3个月时，与部分或完全母乳喂养的婴儿相比，不再母乳喂养的婴儿微生物群多样性和成熟度更高(图1D)。母乳喂养的婴儿在3个月至1岁之间多样性增加，而在3个月前停止母乳喂养的婴儿中没有进一步增加(图1G);微生物群成熟度也有类似的结果(图1G)。综上所述，这些结果表明母乳喂养对肠道菌群多样性以及非母乳喂养婴儿早熟或加速成熟和多样性有剂量依赖性影响。。
图1 婴儿肠道菌群的组成、多样性和成熟度与母乳喂养方式有关
（A-C）冗余分析显示母乳喂养专一性（A）和母乳喂养方式（B）与3个月婴儿肠道菌群组成（n = 653）和母乳喂养持续时间（C）与1年婴儿肠道菌群组成的单变量关联（n= 698）。(D-F) 专一性母乳喂养3个月(n= 653)母乳喂养方式(E)和1年(n=698)母乳喂养时间(F)与肠道菌群多样性(香农指数)和成熟度的关系。(G)在这两个时间点采样的婴儿按母乳喂养时间分层，观察3个月至1年期间肠道微生物群多样性和成熟度的变化。
2 特定的婴儿肠道细菌与母乳喂养的专一性和持续时间有关
在评估整个婴儿肠道菌群的组成和多样性之后，检测母乳喂养方式与婴儿肠道中不同细菌的富集和相对丰度之间的关系（图2）。根据3个月母乳喂养的专一性，观察到ASV的总体相对丰度分布存在明显差异（图2A）。使用多变量线性模型，在3个月时观察到纯母乳喂养的婴儿与不再母乳喂养的婴儿有许多差异，包括4种在纯母乳喂养的婴儿中富集和8种在停止母乳喂养的婴儿中富集(图2B)。专一性母乳喂养富集的4个类群是Haemophilus parainfluenae,Streptococcus和两个未分类的Veillonella dispar。不再喂母乳的婴儿中富集的分类单元包括分类为Blautia，Streptococcus和两个未分类的Lachnospiraceae ASVs（图2B）。在这12种ASV中，有6种在纯母乳和部分母乳喂养的婴儿之间的相对丰度也有所不同。母乳喂养方式与ASV相对丰度也不相关，即使在纯母乳喂养的婴儿中也是如此。1年后，母乳喂养的婴儿肠道中富集4种流行的ASV，包括H.parainfluenzae and V. dispar，而停止母乳喂养后婴儿出现5种常见的ASV，包括Dorea和两种未分类的Lachnospiraceae（图2B）。值得注意的是，两歧双歧杆菌通过母乳喂养富集，而其他双歧杆菌的ASVs则没有。除了母乳喂养方式外，还评估已知的影响婴儿肠道菌群的其他因素进行比较(图2B)。剖宫产与拟杆菌及其他分类差异在3个月时的减少有关。有趣的是，年长的兄弟姐妹的存在与ASV相对丰度有相对较强的关联，影响38种流行的ASV中的19种，包括B.bifidum和 Bifidobacterium。
图2 婴儿肠道中的特定细菌与母乳喂养方式有关
(A) 3个月大时仅接受、部分接受和未接受母乳的婴儿的平均肠道微生物群组成。显示前20个最丰富的ASV。(B)使用调整后的线性回归排列检验，母乳喂养方式与婴儿肠道菌群以中心对数比转化ASV相对丰度的关联。
3 母乳和婴儿肠道的微生物群不同，但是母乳和自己的婴儿肠道之间有一些细菌共享并相关
婴儿肠道中最普遍的菌属与母乳中最普遍的菌属通常是不同的(图3A)。在两种样本类型中，只有Streptococcus和 Veillonella存在于60%以上。总的来说，母乳中以链球菌和葡萄球菌为主，而婴儿肠道中双歧杆菌和拟杆菌为主(图3A)。按Jaccard距离计算，母乳和婴儿肠道的微生物群组成几乎完全不同(图3B)，但有趣的是，3个月时，实际母婴对的婴儿肠道和母乳菌群的相似性略高于随机母婴对的微生物群(p < 0.001)。
接下来，评估个体间ASVs的共享情况。3个月时最常见的共享细菌包括Streptococcus (占61.4%)、V. dispar(35.6%)、Staphylococcus(30.7%)和Bifidobacterium(27.1%)(图3C)。在母乳和婴儿肠道中，总ASVs数量大且范围广(图3D)。值得注意的是，在3个月(p< 0.001)和1年(p = 0.001)时，实际的母婴对比随机的母乳肠道配对更有可能共享5个或更多的ASVs(图3E)，支持一些细菌在母乳和婴儿肠道之间转移的假设。进一步评估母乳中共同细菌的相对富集度与母婴对中婴儿内肠道菌群的相关性(图4)。一般来说，母乳中任何给定的ASV都与婴儿3个月时肠道中相同的ASV相关。这些相关性总是正的，8/13是显著的。乳肠相关性最强的是Rothia mucilaginosa, 三个 Streptococcus ASVs, and 一个 ActinomycesASV(图4A)。相反，在所有其他可能的奶肠ASV对中，只有一小部分相关性是显著的。值得注意的是，不同未分类的 Streptococci种群之间存在负相关，表明可能存在竞争关系。3个月的母乳中共有细菌的相对丰度与1岁婴儿的肠道没有显著相关性(图4B)。
图3 婴儿的肠道和母乳中的微生物群是不同的，但有些细菌在母乳和婴儿的肠道中是相同的
（A）3个月（n =669）和1年（n = 718）的平均母乳菌群组成（n = 799）和婴儿肠道菌群组成。(B)采用线性回归排列检验，母乳和婴儿肠道微生物群的实际母婴对与随机母婴对之间的差异。(C)对于共有的细菌(至少15对的ASVs共有)，母乳和粪便中共有细菌的百分比（左）以及母乳和粪便中的平均相对丰度。（D）密度图显示母乳和实际母婴对的婴儿肠道之间共享ASV数量分布，以及每个母乳和粪便样本中ASV的总数。(E)每个ASV共享类别中实际和随机对的比例。
图4 母乳和婴儿肠道中共有细菌具有相关性
4 母乳和婴儿肠道之间细菌共享的程度与母乳喂养方式有关
接下来，评估母乳喂养的方式是否与母婴对中乳-肠细菌共享的程度有关（图5A）。在3个月时，纯母乳喂养与共有的ASVs数量无关(p =0.19)。然而，母乳喂养方式很重要:直接母乳喂养的婴儿与存储的母乳喂养婴儿相比，拥有5个或5个以上ASVs的比例更高。在1年时，仍母乳喂养的婴儿与停止母乳喂养的婴儿中共享5个或更多ASV的母婴对比例趋于更高（28.4％对18.4％；p = 0.071）（图5A）。然后我们关注最常见的ASVs(图3C)，并评估母乳喂养方式和专一性对婴儿肠道和3个月时母乳中菌群的富集(图5B和5C)和相对丰度(图S5A和S5B)的影响潜力。与直接母乳喂养的母亲相比，有时母乳喂养的母亲体内几种常见细菌的富集情况和相对丰度较低(p (FDR) < 0.05)，包括V. dispar, H. parainfluenzae, and aStreptococcus (图5B)。没有观察到母乳喂养方式和婴儿肠道中的共同细菌之间的关联(图5B)。相反，就母乳喂养的专一性而言，观察到与母乳中共享的ASV几乎没有关联，但与婴儿肠道中ASV的关联却很多：随着母乳喂养的增加，H. parainfluenzae, R. mucilaginosa,Staphylococcus, and Streptococcus增加。两种Streptococcus ASVs和一种Actinomyces降低(p (FDR) < 0.05)(图5C)。从未母乳喂养的婴儿中有0％出现 R. mucilaginosa ，而不再，部分和仅母乳喂养的婴儿中分别有7.3％，14.4％和17.1％（图5C）。总的来说，母乳喂养方式似乎主要影响母乳中的共同细菌，而母乳的专一性主要影响婴儿肠道中的细菌。
在单因素分析中，进一步评估母乳喂养的持续时间是否影响婴儿肠道（包括从未母乳喂养的婴儿）在1年时共同共有的细菌（图5D）。与专一性母乳喂养趋势相似，H.parainfluenzae和 Actinomyces也显示比率随着母乳喂养持续时间的增加而增加，V.dispar和Veillonella parvula也是如此。与不再进行母乳喂养的婴儿相比，在母乳喂养的婴儿中H. parainfluenzae和 V. dispar相对更丰富（图2B）。
图5 母乳喂养方式与母乳和婴儿肠道中的共享细菌有关
(A)在每个ASV共享类别中，与母乳喂养方式有关的母婴对比例。(B-D)母乳喂养方式(B)和专一性(C)与母乳(n = 802)和3个月婴儿肠道(n = 669)中共有细菌(至少15对)的比率有关。(D) 1岁时母乳喂养时间与婴儿1岁时肠道内共有细菌富集情况之间的关系(n = 718)。
5 常见的母乳细菌与婴儿肠道微生物群组成有关
接下来，假设至少有一些共同的细菌代表乳汁细菌，具有转移到婴儿肠道的能力，并且这些细菌可能会影响婴儿肠道菌群的整体组成。为了验证这一点，使用RDA评估母乳中共享菌(n = 13 ASVs)和未共享菌(n = 10 ASVs)的相对丰度，作为母乳喂养婴儿肠道微生物群组成可能变异的来源(图6A)。其他母乳和早期生活因素的影响也进行比较，共有的母乳细菌与3个月的婴儿肠道菌群有关（R 2 = 1.04％的变异，p = 0.003），而未共享的母乳细菌则没有（p = 0.873）。共享和不共享的母乳细菌都解释了1年时类似的较低的变异水平。值得注意的是，与该微生物群落的几个众所周知的决定因素相比，共有的乳细菌解释了三个月婴儿肠道菌群的更多变异，包括母乳喂养专一性，分娩方式，产时抗生素的使用和年长的兄弟姐妹。最后，调查母乳中每种共享细菌对观察到的婴儿肠道菌群变化的贡献(图6B)。Streptococcus,Streptococcus, and Bifidobacterium与3个月的肠道菌群组成有关，只有Bifidobacterium and Streptococcus在1年后与肠道微生物群显著相关。
图6 母乳中的细菌与婴儿肠道菌群组成有关，其强度可与其他因素相提并论
冗余分析显示(A)乳汁细菌、其他乳汁成分、母乳喂养方式和其他相关协变量所解释的肠道微生物群的变异百分比，以及(B)共享的乳汁菌群。
讨论
1.母乳喂养方式塑造了婴儿肠道菌群，并影响母婴共享细菌
研究证实，母乳是婴儿肠道菌群发育的主要驱动力，并提供母乳细菌促成这一影响的证据。这些结果进一步证明，母乳可能会在婴儿的肠道中埋下来自母亲或其他外源性来源的细菌。对于婴儿总体肠道菌群组成和某些个别肠道类群，观察到根据母乳喂养的专一性和持续时间的剂量依赖性关系。到在12个月仍用母乳喂养的母婴对中，ASV的同时发生率更高，表明持续母乳喂养有助于通过母乳持续进行细菌转移。根据母乳喂养方式，没有发现明显的肠道分类学差异。然而，用泵取奶与母乳中某些共享细菌的消耗有关，并且似乎减少母婴细菌共享的数量。认为一些共享的细菌可能会在直接哺乳期间转移到母乳中，这支持了这样一种假设，即婴儿的口腔可能被环境细菌占据，这些细菌分散到母乳(通过直接哺乳期间的逆行转移)和婴儿的肠道。事实上，研究中发现的一些共有细菌，包括V. dispar and H. parainfluenzae，都是常见的口腔细菌，在直接母乳喂养的母亲的母乳中富集。无论乳汁细菌起源于何处，我们的数据都支持以下假设:(1)母乳可能起到培养箱的作用，丰富某些细菌，或者是将细菌输送到肠道下部的保护性载体;(2)习惯性的用泵取奶改变母乳中的细菌组成。也有可能母乳细菌的生存能力可能受到泵送、储存(如冷冻、解冻)和奶瓶喂养过程的影响，但我们的研究未对此进行评估。未来的研究将受益于对牛奶、口腔和肠道微生物群的纵向取样，明确这些微生物群落之间的动态关系，并确定它们如何受到母乳情况、储存和喂养方式的影响。
2. 母乳中的细菌会在婴儿的肠道中繁殖，影响健康
母乳微生物群对肠道微生物群发育的重要性是一个不断争论的问题，但是在系统发育多样的动物物种的母乳中微生物的存在表明其进化保守性和功能意义。据推测，母乳通过母亲的垂直传播或乳汁细菌外源(如家庭环境或婴儿口腔)的水平传播，将细菌提供给婴儿的肠道。与之前的研究一致，还发现母乳可能会特别向婴儿的肠道提供Veillonella, Rothia, Streptococcus,Bifidobacterium, Haemophilus, and Staphylococcus。值得注意的是，没有一种细菌是在所有母婴对中共同存在的，可能反映母乳菌群分布的个体间差异。然而，随着长期和直接母乳喂养而增加的共享以及母乳和肠道中共享细菌的相对丰度之间的强正相关性提供证据，表明某种程度的细菌播种是合理的。
在儿童队列和其他研究中观察到，母乳中的细菌转移可能有助于母乳喂养对健康的有益影响，包括降低儿童哮喘和肥胖症的发病率，这些疾病也与早期肠道微生物群紊乱有关。值得注意的是，在儿童组中，观察到在接受存储的母乳喂养的婴儿中，对哮喘的保护略弱，而且超重。目前的发现表明，这可能是由于母乳中细菌的共享或传播减少所致。研究中鉴定出的特别感兴趣并可能影响免疫稳态的共有细菌包括Rothia，Veillonella和Bifidobacterium。在3个月的粪便中，Rothia and Veillonella先前被证明对儿童队列中的特应性喘息具有保护作用。有趣的是，Veillonella具有将乳酸转化为丙酸盐和丁酸盐的能力，而这些短链脂肪酸(SCFA)与积极的健康结果和免疫调节作用有关。同样，一些Bifidobacterium spp也专门分解HMOs，并产生其他微生物群利用的代谢物，这些微生物随后产生SCFAs。有必要进行进一步的研究来探讨牛奶和粪便中共同存在的细菌的治疗应用，这些细菌本质上可以承受通过胃肠道的运输。
对于鉴别母乳和婴儿肠道中共有的细菌，考虑其他解释是很重要的：除了反映乳汁内细菌(外源性或内源性)向婴儿肠道的传播外，这两者都有可能是由相同的外源性来源(如婴儿的口腔或家庭环境)分别接种的。还有一种可能是，母乳及其菌群(不论其来源)影响口腔和呼吸道的微生物群落，并独立于肠道菌群影响婴儿健康。需要进一步的研究确认母乳是否以及如何将细菌转移到婴儿的肠道，并确定母婴菌群对健康的影响。
3.母乳细菌在全球范围内独立于HMOs影响婴儿肠道菌群
如果母乳中的活菌可以到达婴儿的肠道，它们可以通过定植和/或与驻留的肠道微生物相互作用影响肠道菌群的组成。例如，早期肠道微生物群落改变肠道环境，促进其他细菌的生长，导致群落的演替性变化。结果支持这一假设，并表明母乳中的细菌与婴儿微生物群的其他已知决定因素（例如，分娩方式和分娩期抗生素）的变异程度相似，虽然很难直接比较这些效果评估，因为母乳中的微生物群是在粪便收集的同一天评估的，而分娩方式和产时抗生素代表了几个月前发生的变化。重要的是，我们观察到的关联与HMO无关，表明母乳通过提供益生元和益生菌因子在调节婴儿肠道微生物群中具有双重作用。需要进一步的研究来确认母乳是细菌的来源，同时控制其他重要的母乳成分，这些成分可能会调节婴儿肠道的生理和免疫生态位。此外，整合来自其他母婴微生物群落数据的研究可以进一步了解母婴细菌转移的途径，机制和影响。
评论
（1）尽管肠道菌群和母乳菌群非常不同，母婴对中的婴儿肠道菌群和母乳菌群还是相关的；
（2）一些与母乳喂养方式相关的常见细菌可能会在母乳中转移到婴儿肠道或从婴儿转移到母乳中；
(3)母乳中常见的细菌可能会影响婴儿整体肠道微生物群的组成，而不受其他早期生活因素(包括HMO和出生方式)的影响。
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