科研 | Nature子刊：天然根际微生物对铁的竞争可以调控植物病原菌（国人作品）
编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。
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植物病原菌引起的病害给人类社会造成了严重的作物和经济损失。这些病原体通过植物、病原菌和植物微生物之间的复杂相互作用而发生，因此很难有效的控制。在微生物范围内对这种自然生态系统的实验研究很少，因此我们对有关微生物分类和功能的组成以及由此产生的生态相互作用如何影响病原菌的生长和疾病发生的了解很少。
本研究中，基于分子水平上对土壤微生物组进行分析，同时结合体外和植物生物测定发现，铁载体分子的分泌对铁产生的竞争是微生物-病原体相互作用和植物保护的一个很好的预测因子。我们在80个根际微生物菌群中探究了2150个单个细菌组分抑制Ralstonia Solanacearum的能力（一种能够感染各种作物的全球性植物病原体），我们所研究的所有细菌组分涵盖了主要的系统发育谱系。
通过研究发现，分泌的铁载体改变了微生物菌群与病原体的相互作用，从完全的病原体抑制转变为强烈的促进作用。含有生长抑制铁载体的根际微生物组分在体外、自然土壤以及温室土壤中能够抑制病原菌的生长，以保护番茄植株免受侵染。然而，含有促生长铁载体的根际微生物组分往往在竞争中处于劣势，并促进了病原菌对植物的侵染。由于铁载体是一组化学上不同的分子，每种铁载体类型都依赖于一个兼容的铁摄取受体，我们的结果表明，抑制病原体的微生物组分能够产生病原体不能使用的铁载体，从而抑制了病原体的生长。研究建立了微生物水平的铁竞争和植物保护之间的因果机制，并为利用铁载体介导的相互作用作为微生物工程和病原菌控制的工具开辟了很有前途的途径。
论文ID
原名：Competition for iron drives phytopathogen control by natural rhizosphere microbiomes
译名：天然根际微生物对铁的竞争调控了植物病原菌
期刊：Nature Microbiology
IF：14.3
发表时间：2020年5月11日
通信作者：韦中，徐阳春
通信作者单位：南京农业大学
研究背景
土传病原体对粮食生产具有全球性的危害。植物根系相关微生物菌群被视为是天然抗病性的潜在驱动力，并已成为意在改善作物保护的创新策略的目标。然而，我们预测和设计微生物功能的能力仍然非常有限，过去的研究主要集中在两条相互不相关的方向上。其中一个方向是在用比较的方法揭示了微生物群落结构和潜在的病原菌抑制性状与植物健康之间的相关性。另一个方向聚焦于在特定的系统上，机械地测试诸如抗生素、资源竞争和植物免疫激活等因素是否会影响植物保护。尽管前一个方向揭示了与病原菌抑制相关的潜在的重要候选性状、物种和功能，但其对潜在的因果机制方面的理解有限。相反，后一条线提供了具体的机械性见解，但其很难得到具有普适性的规律。因此，在很大程度上还不清楚根际中哪些细菌类群和什么类型的生态相互作用决定了土传病原体的疾病结果。
研究内容
为了评估微生物体内的铁竞争在植物保护中的作用，我们首先表征了四个不同的田地中收集的80个番茄根际微生物群，这些微生物菌群都被Ralstoniasolanacearum侵染。其主要包括Proteobacteria（28%）、Bacteroidetes（18%）、Planctomycetes（9%）、Patescibacteria（8%）、Actinobacteria（6%）、Acidobacteria（6%）以及Firmicutes（4%），共计293科756属。随后，我们随机分离并鉴定了2150个可培养细菌，这些细菌涵盖了存在于植物根际中的四个主要系统发育谱系，这些微生物类群同样也存在于我们的土壤微生物群中，其中包括Proteobacteria（50%）、Firmicutes（24%）、Bacteroidetes（18%）和Actinobacteria（8%）；在内的35科83属。因此，这些微生物类群的集合在一定程度上代表了我们土壤微生物群落的分类。
我们使用coulometricchrome azurol S （铬天青S，CAS）法来估计所有2150个细菌分离株上清液中分泌的铁载体的水平，其中95%的分离株产生铁载体（图1a，b）。由于本研究还对其他有机铁结合化合物的结合活性进行了测定，因此对于背景CAS值的评估是十分重要的。在富铁条件下，对CAS进行重复分析时我们发现，与富铁条件相比，高达99%的产铁载体微生物在铁限制的条件下上调了铁载体的产量。在铁限制下，铁载体的产量遵循双峰分布，菌株要么产生高数量的铁载体，要么产生低数量的铁载体（图1a）。所有分离物的铁载体产量（即CAS活性）都预示着在铁限制的条件下细菌的生长（R2=0.388，n=2,150；图1b），但在富铁的条件下几乎没有影响（R2=0.039，n=2,150；图1b）。这些结果表明，铁载体的产生是所有分类群和采样点中存在的普遍特征并在铁限制条件下对细菌的生长具有十分重要的作用。
进一步，我们评估了来自不同分离株的铁载体对R. solanacearum（QL-Rs1115）生长促进或抑制的潜力。首先通过在富铁条件下收集细菌上清液来饲喂病原体（这些细菌上清液中含有少量的铁载体，但可能还有其他分泌的化合物和残留的营养物质），进而对病原体进行基线处理。我们发现，这些上清液对R.solanacearum的生长有温和但整体上具有显著的促生长作用（图1c）。相反，当采用在铁限制条件下收集的细菌上清液来饲喂病原体时（包含更多的铁载体），我们发现这种促生长影响要明显得多（图1c）。这些作用范围从几乎完全抑制R. solanacearum的生长到高度促进R. solanacearum的生长。为了验证观察到的富铁和铁限制条件下生长效应的差异是否真的归因于铁载体而不是由在铁限制下可能上调或下调的其他分泌代谢物，我们将病原体暴露在铁限制的上清液中，同时补充铁以抑制铁的竞争。在这些上清液中加入铁可以中和铁载体的影响，但保留了其他分泌代谢物（例如抗生素）对病原体生长的影响。我们发现，补铁的上清液与富铁的上清液具有相同的作用（温和的促进作用），这表明在铁限制的条件下，铁载体是细菌相互作用的主要驱动力。在估计铁载体的净效应时（图1c），我们发现铁载体可以解释R. solanacearum上清液介导的76%的总生长效应（R2=0.755，n=2,150，P<0.0001；图1c）。
为了从实验上证实含铁载体可以驱动细菌-病原体的相互作用，我们在两个已定义的含铁载体产生菌（产生pyoverdine和pyochelin的Pseudomonas aeruginosa PAO1；产生ornibactin和pyochelin的Burkholderia cenocepacia H111）及其同基因无效突变体的存在下培养R. solanacearum，这些突变株由于基因工程技术删除了含铁载体基因从而不能产生铁载体。我们发现野生型菌株的培养上清液（含铁载体）对病原菌的生长有抑制作用。相反，当病原体暴露于两个物种铁载体缺乏的突变体的上清液时，这些抑制作用完全消失。为了进一步证实铁载体在介导种间相互作用中的重要性，我们分离纯化了四种不同Pseudomonas spp.分离株的pyoverdines类化合物，并将病原体暴露在这些铁载体上。通过观察我们发现，在铁限制的条件下，所有四个铁载体都抑制了病原体的生长，这一结果与铁限制条件下的上清液培养的抑制效果相同。最后，我们探究了R.solanacearum QL-Rs1115在单培养条件下的生长和含铁载体的产生情况。我们发现病原体在铁限制培养基中的生长受到限制，在铁限制条件下，上调了铁载体的产量到中等水平（CAS值=0.462），并在自身铁限制的上清液中补充铁载体时刺激生长。综上所述，这些结果表明在铁限制条件下，铁载体在介导根际分离物与R. solanacearum QL-Rs1115之间的相互作用中起着关键作用。
进一步，我们探究了细菌分类是否可以预测铁载体的产生，以及铁载体对病原体的介导作用。我们发现这两个性状都表现出显著的系统发育信号（对于铁载体生产而言，其Abouheif ’s Cmean=0.262，对于铁载体介导的生长效应来说其值为0.148，两者P<0.001），但这两个性状的系统发育信号都相对较弱（当Cmean=1时代表所有观察到的变异都是由系统发育来解释的）。这表明，铁载体的产生和铁载体介导的生长效应在相关菌株之间都有很大的不同。通过ancestral character statereconstruction分析有效的验证了我们的这种猜想。该分析表明，高水平的铁载体生产和铁载体介导的生长效应独立地多次进化。进一步对18个最常见的属的集中分析证实，共同的谱系发育和属内的差异都是造成性状差异的原因（图2b）：（1）某些属在它们的铁载体产量和它们对R. solanacearum生长的影响程度上明显不同（例如，Enterobacter和Bacillus）；（2）在这两个特征上，相同属内的菌株之间有很大的差异（例如，Bacillus spp.）。
在定量水平上，我们发现通过系统发育距离和铁蛋白生成的叠加效应可以用来预测R. solanacearum生长的抑制，其中最具抑制作用的菌株是那些与病原菌关系相对密切并产生大量铁载体的菌株（图2c；整个模型R2=0.255，n=2,150）。由于系统发育效应和生态学理论预测之间的生态位可能有所重叠，因此这种系统发育效应与生态学理论预测的资源竞争加剧通常是一致的。为了验证铁载体产生水平和铁载体介导的生长效应之间的影响，我们重复的进行了独立系统发育对比，从而过滤掉了仅由系统发育解释的变异。这一分析证实，与低产铁载体的菌株相比，高产铁载体的菌株更有可能抑制R.solanacearum的生长。
我们进一步探究了铁载体介导的生长效应是否可以预测2150个根际分离物与R. solanacearum共培养时直接竞争的结果。我们发现，当与产生抑制性铁载体的分类群竞争时，病原菌的生长显著减少（R2=0.16，n=2,150；图3a）。为了检验铁载体介导的生长效应是否与病原菌和根际细菌在自然田间条件下的共生模式相一致，我们利用16S rRNA对整个微生物群落进行测序同时进行定量PCR（qPCR）技术对80个土壤样品中各分类单元与病原菌的共生模式进行了评估。通过实验，我们得到了病原体普遍存在情况，同时在每个微生物组中获得了2150个分类群。随后，我们将这些普遍存在情况与80个微生物组之间进行了关联。我们发现，铁载体介导的相互作用与田间物种共存相关：在病原菌丰度较高的条件下，产生抑制铁载体的类群倾向于在高密度下与病原菌共生（正回归系数，r），而产生促进铁载体的类群倾向于在低密度下发生（负r，R2=0.113，n=2,150，图3b）。这些协方差模式在土壤pH值高的地点最强，在这些位点中，其铁的有效性最低，最需要铁载体（图3b，插图）。虽然许多其它未知的因素可以影响田间分类群的丰度，但我们的结果表明，铁载体介导的相互作用可能是一种普遍的机制，它实质上影响了从天然根际微生物群分离的病原菌和类群之间的竞争结果和共生模式。此外，铁载体预测物种相互作用的能力似乎随着环境参数的不同而变化，这些参数直接影响土壤中铁的限制水平，我们认为其他环境因素，如总体铁含量和养分有效性，也可能有类似的影响。
最后，我们通过在3个最为丰富的菌属中的360个分离株（Bacillus，平均促进作用；Enterobacter和Chryseobacterium平均抑制作用；每个菌株分别包括120个分离株）随机选择其中的一个预先定植在番茄植株中，以此探究铁载体介导的相互作用是否会影响病原体侵袭根际微生物群并导致疾病的能力。我们发现，铁载体介导的相互作用与病原菌生长和植物保护都有显着的关联（图4）。当预先接种的细菌分离物产生促进铁载体时，植株的发病率和病原菌密度最高，但当植物预先接种产生抑制铁载体的细菌时，植株的发病率和病原菌密度下降（图4a-c）。重要的是，铁载体介导的对感染结果的影响不依赖于其所在的属。此外，病原菌密度与发病率之间表现出呈正相关（图4d），这一结果表明，抑制病原菌生长在疾病控制中起着关键作用。尽管本研究所提出的所有关联都很重要，但我们必须要意识到它们仅解释了所观察到的总变异的相对较低水平。这表明除了铁载体外，其他因素也会影响感染结果。总之，我们的感染实验与（体外和现场）观察到的生长和共生模式很好地匹配，这表明铁载体介导的相互作用在许多情况下对病原体抑制和疾病结果提供了实质性贡献并可靠地预测了疾病结果。
结论
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